Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de Gotas de Matriz Semisólida (< 1 min por placa)
- Coloque una placa de vidrio preenfriado en el fondo de un pozo sobre un bloque de hielo debajo del microscopio operativo. Asegúrese de que la alícuota de la matriz permanezca en el hielo en todo momento.
- Coloque una gota de matriz de 1,5 μL en cada una de las cuatro esquinas de la placa con fondo de vidrio con un micropipeteador de 2 μL o 10 μL, dejando una distancia al menos tan grande como la propia gota desde el borde del pocillo de vidrio.
- Coloque la punta de la pipeta directamente sobre el vidrio en un ángulo de 45 grados. Pipetear lentamente la matriz. Aléjese lentamente del fondo de vidrio después de que la matriz se haya enganchado en la placa.
nota: La tensión superficial entre la matriz y el vidrio debe crear un hemisferio perfecto cada vez.
- Deje de pipetear justo antes de que la punta esté vacía porque la inyección inadvertida de aire en la gota de matriz hace que el diámetro de la gota de matriz sea mucho mayor y sea difícil de eliminar.
nota: El uso de una segunda mano para estabilizar la mano de pipeteo facilita una colocación más precisa.
>2. Inserción de DRG en gotas de matriz semisólida (< 2 min por placa)
- Deje la placa con las gotas de la matriz brevemente a temperatura ambiente (~1 min). Esto endurece ligeramente la matriz, lo que facilita la colocación precisa del DRG.
- Tome suavemente (no agarre) el DRG con pinzas microscópicas cerradas en la mano izquierda. Una vez más, un fondo oscuro contra el pequeño DRG blanco facilita la visualización. Transfiera el DRG a la punta de una aguja de 21G en la mano derecha. Esta transferencia dejará medios residuales en las pinzas.
- Inserte suavemente el DRG en el centro de la gota de la matriz con la aguja 21G (Figura 1). La mayoría de las veces, el DRG se liberará fácilmente en la matriz y luego se puede colocar en el centro con la aguja.
- Si el DRG se adhiere a la aguja, use las pinzas microscópicas para empujar el DRG fuera de la aguja y dentro de la gota de la matriz. Absorba el exceso de medio de las pinzas microscópicas con una toallita de laboratorio.
nota: La introducción de medios en la matriz alterará el diámetro, el volumen y la consistencia del ensayo. Un bloque de hielo con escritura en color o en color proporciona contraste de fondo, lo que facilita la visualización de este delicado proceso.
- Después de que la placa tenga los cuatro DRG, realice una inspección final para asegurarse de que el DRG esté en el centro de la gota de la matriz. Realice los ajustes necesarios con la aguja 21G.
- Transfiera la placa completa a una incubadora a 37 °C. Esto solidificará la matriz semisólida y fijará el DRG en su posición.
- Repita este proceso para todos los DRG. Coloque las gotas de matriz en blanco sin un DRG como control negativo.
- Agregue 4 mL de DMEM con un 10% de medio FBS a cada placa con fondo de vidrio después de completar todas las placas y exponerlas a la incubadora a 37 °C durante al menos 3 min. Coloque la placa en un ligero ángulo y agregue lentamente el medio, de modo que gradualmente entre en contacto con las unidades de matriz DRG.
nota: Si el medio se añade demasiado rápido o con demasiada fuerza, la matriz y/o el DRG pueden desprenderse.
- Almacene los ensayos en la incubadora a 37 °C durante los siguientes 48-72 h.
nota: El examen periódico de los ensayos mostrará el crecimiento circunferencial de las neuritas hacia el borde de la matriz (Figura 2). Cuando las neuritas están a más de tres cuartos del camino hacia la matriz, es apropiado colocar las células en placas.
>3. Preparación de las células cancerosas de cabeza y cuello
NOTA: En este diseño experimental se pueden utilizar líneas celulares distintas de las células de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello.
- Mantenga líneas celulares de carcinoma de células escamosas en DMEM con 10% de FBS en matraces o placas de cultivo preferidos en una incubadora a 37 °C. Para preparar las células para la experimentación, succionar todo el medio del matraz o plato de cultivo y lavarlo dos veces con PBS. Suspenda las células añadiendo una cantidad adecuada de tripsina al 0,025% durante 5 min, seguido de DMEM con un 10% de FBS. Pipetear 4 mL de la mezcla de células y medios en placas de cultivo de 6 mL.
nota: Una placa de cultivo de 6 mL proporciona células más que suficientes, incluso cuando menos del 50% confluentes.
- Exponga las líneas celulares HNSCC a diferentes condiciones 24 horas antes de la tinción y la colocación de placas en el ensayo DRG. Vuelva a dosificar la afección una vez que las células estén cubiertas para mantener un ambiente consistente.
nota: Agregue anticuerpos, factores de crecimiento, citocinas u otras moléculas a las placas de cultivo celular 1-2 días después de la disección del ratón y la implantación del DRG en la matriz.
- Agregue tinciones de células fluorescentes 1 h antes de sembrar las células (2-3 días después de la cosecha de DRG y la implantación en la matriz).
nota: Las tinciones particulares utilizadas aquí pasan libremente a través de la membrana celular; Sin embargo, después de reaccionar con los grupos tiol intracelulares, la tinción permanece dentro de la célula y se transmite a las células hijas. La tinción facilita enormemente la visualización dentro de los ensayos. Estas tinciones temporales son ideales para estos ensayos porque la fluorescencia está presente durante 2-3 días, que es el período de tiempo de estos experimentos. También permite el uso de muchos colores diferentes y evita la necesidad de crear líneas celulares transfectadas con proteínas fluorescentes.
- Prepare 10 μM de solución de colorante mezclando 2 μL de tinciones de células madre de 10 mM en 2 mL de DMEM sin suero para cada condición celular. Caliéntelo a 37 °C antes de agregarlo a las celdas.
- Retire el medio de cultivo dentro de la placa de 6 ml, dejando las células HNSCC adheridas en la placa. Agregue 2 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y retire 2 mL de los 10 μM de DMEM sin tinción/suero celular agregados a cada placa.
- Vuelva a colocar la placa de cultivo de 6 mL con la tinción celular en la incubadora a 37 °C durante 40 min.
- Después de 40 min, aspire el medio. Agregue 2 mL de PBS y luego aspire. Añada 1 mL de tripsina al 0,025% a cada placa y reemplácelas en la incubadora a 37 °C.
- Agregue 2 mL de DMEM con FBS al 10% después de 3-5 min y transfiera las células suspendidas a un tubo cónico de 15 mL. Girar las células y volver a suspenderlas en 1 mL de DMEM con 10% de FBS.
- Cuente las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado y luego agregue DMEM con 10% de FBS para crear una concentración celular final de 300,000 células por mL.
>4. Recubrimiento de células cancerosas de cabeza y cuello
- Retire las placas con fondo de vidrio con los ensayos de matriz DRG de la incubadora.
nota: Una vez más, son apropiados cuando las neuritas están al menos al 75% del camino hasta el borde de la matriz, lo que generalmente ocurre después de 2-3 días. Esto se ve mejor usando al menos un objetivo 10X.
- Aspire el medio dentro de la placa con fondo de vidrio. Aspire completamente el medio dentro del pozo de vidrio sin quitar las unidades de matriz-DRG.
- Extraer 200 μL del medio de 300.000 células/mL con una pipeta de 200 μL. Coloque dos gotas de las células sobre cada ensayo de matriz DRG. Realice este paso para cada gota de la matriz, creando cuatro repeticiones de cada condición de celda en una placa.
nota: La forma hemisférica de la matriz permite que las células se asienten en un anillo a lo largo de la periferia del ensayo (Figura 3a, Figura 3b). Encontrar una pipeta con un gatillo suave hace que la colocación de gotas uniformes sea mucho más fácil.
- Confirme el número de células similares y la distribución de las diversas condiciones celulares bajo microscopía 4X.
- Coloque las placas con fondo de vidrio en la incubadora a 37 °C durante aproximadamente 60 min.
nota: Aunque solo hay un pequeño volumen de células y medios (~150 μL), los ensayos no se secan hasta que han transcurrido varias horas de tiempo de incubación.
- Después de 60 minutos, agregue suavemente 4 ml de DMEM con 10% de FBS a lo largo de la pared lateral de la placa con fondo de vidrio.
nota: Durante un período de tiempo, las células se adhieren parcialmente al fondo de la placa y el método de adición del medio no perturba las células. Los diferentes tipos de células pueden tardar más o menos tiempo en comenzar a adherirse a la placa con fondo de vidrio.
- Reemplace cualquier medicamento exógeno o factor de crecimiento en este momento para mantener los niveles de concentración anteriores.
- Devuelva los ensayos a la incubadora a 37 °C, excepto cuando se examinen microscópicamente. Cuantificar los resultados de este ensayo mediante imágenes microscópicas. Brevemente, cuente las hebras de invasión perineural dentro de cuatro cuadrantes usando una imagen microscópica 4X.
nota: Un microscopio con un objetivo 4X y capacidades de fluorescencia es adecuado para fotodocumentar los ensayos. El tamaño de los ensayos encaja muy bien dentro del campo de un objetivo 4X, que es lo suficientemente detallado como para capturar las áreas individuales de invasión perineural. La invasión perineural se hace evidente dentro de las 24 horas, pero después de las 48 horas, la integridad de los ensayos comienza a debilitarse, a medida que las células tumorales se dividen a lo largo de la periferia de la matriz e invaden. Más allá de las 48 h, también hay un flujo sustancial de fibroblastos del DRG, lo que oscurece la visualización mediante microscopía de campo claro. Por lo tanto, es aconsejable fotodocumentar los resultados con microscopía 4X al menos dos veces durante este período (por ejemplo, a las 24 y 48 h después de la siembra de las células tumorales). Tenga en cuenta que estos son ensayos tridimensionales y es difícil obtener una imagen completa del ensayo. La mayor parte de la invasión perineural ocurre en un plano desde la parte inferior de la placa, donde las células están incrustadas en la matriz ligeramente por encima de la parte inferior de la placa. Debido a que este plano está cerca de la horizontal, la gran mayoría de las neuritas con células tumorales se capturan en una imagen de un solo nivel a 4X.
