Ensayo de discriminación poblacional del lado del cáncer: un método para aislar células madre cancerosas mediante el ensayo de eflujo de colorante de Hoechst

Resumen

Fuente: Gilormini, M. et al. Aislamiento y caracterización de una subpoblación de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello con características de células madre. J. Vis. Exp. (2016)

En este video, describimos el aislamiento de una subpoblación de células madre cancerosas de líneas celulares de carcinoma escamoso de cabeza y cuello utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia o FACS. La población lateral aislada de las células se puede utilizar para un análisis posterior posterior.

Protocolo

>1. Selección de una población lateral (SP) mediante el ensayo de eflujo de colorante de Hoechst

1. Tinción de 50 millones de células con el colorante Hoechst 33342
   1. Prepare dos tubos estériles de 15 mL con fondo cónico: un tubo etiquetado como "Hoechst" y el otro etiquetado como "Hoechst y Verapamilo". Prepare 10 mL de solución de clorhidrato de verapamilo de 5 mM en agua estéril. Prepare el medio de cultivo (CM) para las células madre.
      1. Para preparar la MC para CSC (CM-CSC), combine lo siguiente: medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM): F12 (1:3, v:v), 5% de suero fetal de ternero (FCS), 0,04 mg/L de hidrocortisona, 100 U/mL de penicilina, 0,1 g/L de estreptomicina y 20 μg/L de factor de crecimiento epidérmico (EGFR).
   2. Bajo una campana de flujo laminar, tripsinizan las células. Retirar el medio, lavar con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y añadir 1 mL de tripsina-EDTA (0,5 g/L) para obtener un matraz de 75 cm². Incubar 3 min a 37 °C. Detenga la reacción añadiendo un medio de cultivo utilizado para la línea celular parental. Cuente el número de celdas usando un contador de celdas.
      1. Para preparar la MC para la línea celular parental (CM-P), suplementar DMEM con FCS al 10%, 0,4 mg/L de hidrocortisona, 100 U/mL de penicilina y 0,1 g/L de estreptomicina).
   3. Diluir la suspensión celular obtenida en el paso 1.1.2 para obtener 10⁷ células/mL en CM-P. Divida la suspensión celular en los dos tubos preparados: ponga 100 μL (10⁶ celdas) en el tubo "Hoechst y Verapamil" y 4 mL (4 x 10⁷ celdas) en el tubo "Hoechst".
   4. En la muestra "Hoechst y Verapamilo", añadir 10 μL de 5 mM de solución de clorhidrato de verapamilo (concentración final: 0,5 mM) y mezclar suavemente. Añadir 5 μL de 1 g/L de solución de Hoechst (concentración final: 0,1 g/L). En la muestra "Hoechst", añadir 5 μL de 1 g/L de solución de Hoechst por cada 10⁶ células (200 μl en total). A partir de ahora, mantenga las muestras protegidas de la exposición directa a la luz con papel de aluminio.
   5. Incubar todos los tubos en un baño de agua a 37 °C durante 1 h 30 min. Mezclar suavemente cada 15 min para evitar que las células se asienten.
   6. Centrifugar los tubos a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet con 2 mL de 1x PBS.
   7. Centrifugar los tubos a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet "Hoechst y Verapamilo" en 500 μL de yoduro de propidio (PI) de 5 mg/L diluido en tampón PBS y el pellet "Hoechst" en 4 mL de 5 mg/L de PI diluido en tampón PBS.
   8. Transfiera las soluciones de muestra a través de un filtro de células de 70 μm para eliminar agregados y recolectar células individuales en tubos para la absorción de muestras en el citómetro de flujo. Mantenga las muestras en hielo y protéjalas de la exposición directa a la luz con papel de aluminio.

>2. Aislamiento de la población lateral excluyendo el colorante Hoechst por clasificación de células

1. Realice la separación de células negativas de Hoechst en un clasificador de citometría de flujo con los siguientes parámetros: láser UV (355 nm), dos detectores en la trayectoria del láser UV con filtros Hoechst azules (450/50 BP) y Hoechst rojos (610/20 BP), y dos colectores.
   1. En primer lugar, analice la muestra "Hoechst" que sirve como control positivo para la tinción y la configuración del citómetro de flujo.
   2. Usando el software del citómetro, en la ventana "Hoja de trabajo global", haga clic en "Diagrama de puntos" (quinta imagen superior derecha) y cree un gráfico en la hoja de trabajo global. En la ordenada, con un clic derecho, seleccione FSC-A (dispersión directa) y en abscisa, SSC-A (dispersión lateral) (Figura 1A). De la misma manera, cree un diagrama de puntos SSC-W frente a SCC-H. En este segundo diagrama de puntos, para crear una región P1, haga clic en "Puerta de polígono" (decimocuarta imagen superior derecha) (Figura 1B).
      nota: La región P1 abarcará células individuales y dobletes discriminados.
   3. Opcional: Excluya las celdas positivas de PI mediante la creación de un FSC-A frente a PI activado en P1. En este diagrama de puntos, seleccione la población PI negativa (P2) para excluir las células muertas PI positivas.
   4. Usando el software del citómetro, en la ventana "Hoja de trabajo global", haga clic en "Diagrama de puntos" y cree un gráfico en la hoja de trabajo global. En la ordenada, con un clic derecho, seleccione Hoechst-A azul y en abscisa, Hoechst-A rojo. Con un clic derecho en la población, seleccione "Mostrar población" y P1. En este diagrama de puntos, cree una región (P2) para seleccionar las células negativas de la población lateral (SP) del colorante de Hoechst que aparecen como un brazo lateral a la izquierda de la población principal de células (Figura 1C).
2. Analice la muestra "Hoechst" y recopile 10.000 eventos. Para asegurarse de que la puerta P2, que representa la población de SP, está bien posicionada, se analiza la muestra "Hoechst y Verapamilo" (10.000 eventos) para observar la desaparición de la población de SP (Figura 1D).
3. Recoja las células negativas del colorante SP Hoechst en un tubo de 15 mL que contenga 1 mL de CM-CSC preparado en el paso 1.1.1.
4. Al final de la clasificación de células, centrifugar la suspensión celular a 250 x g durante 5 min, eliminar el sobrenadante y volver a suspender el pellet con 1 mL de CM-CSC. Cuente el número de células clasificadas utilizando un contador de células y transfiera un número adecuado de células a un matraz de cultivo (véase la Tabla 1). Añadir CM-CSC e incubar a 37 °C y 5% de_CO2 en atmósfera.
5. Mantener las células en cultivo en las mismas condiciones durante un máximo de dos pasos hasta que haya un mínimo de 5 x 10⁷ células.

Tabla 1: Tipo de matraz de cultivo a utilizar según el número de células clasificadas. Se detallan el tamaño del matraz de cultivo para un número aproximado de células clasificadas. También se proporciona el volumen de tripsina y el volumen de medio requerido para el tipo de matraz de cultivo.

Número de celdas ordenadas	Tipo matraz de cultivo	Volumen de tripsina (mL)	Volumen medio de cultivo (mL)
10.000-200.000	1 pocillo de una placa de 6 pocillos o una placa de Petri de 3,5 cm	0.5	número arábigo
200.000-1.000.000	1 matraz de cultivo T25	1	4
>1.000.000	1 matraz de cultivo T75	número arábigo	10

Resultados

Figura 1: Aislamiento de una población lateral excluyendo el tinte Hoechst.(A) Diagrama de puntos FSC-A versus SSC-A. (B) Diagrama de puntos SSC-W versus SSC-H. (C, D) Diagrama de puntos Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A utilizando el tubo "Hoechst" (C) o con el tubo "Hoechst y Verapamilo" (D).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suero de becerro fetal oro	GE Cuidado de la Salud	A15-151
Hidrocortisona soluble en agua	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicilina/Estreptomicina 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Mezcla de frutos secos (1x) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
FEAG	Promega	G5021	La solución debe estar preparada justo antes de usarlo porque es muy inestable
heparina	Tecnologías StemcellTM	7980
B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A	Gibco	12587-010
Penicilina/Estreptomicina 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosivo, toxicidad aguda (oral, dérmica, por inhalación) categoría 4
Clorhidrato de verapamilo	Sigma-Aldrich	V-4629	Toxicidad aguda (oral, dérmica, inhalación) categoría 3
Yoduro de propidio	Sigma-Aldrich	P4170	Toxicidad aguda (oral, dérmica, por inhalación) categoría 4
Línea celular SQ20B	Regalo de John Little's Laboratorio	-
Línea celular FaDu	ATCC	HTB-43
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biociencias	-