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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Recolección de la médula espinal
- Eutanasia al ratón usando una cámara de CO2. Evite la dislocación cervical, ya que podría dañar las raíces ganglionares debido a las fuerzas de cizallamiento. A partir de aquí, realice todos los pasos en condiciones estériles.
- Remojar el animal con etanol al 70%. Este paso es importante para la esterilización y para evitar que el vello se arrastre a través de los órganos internos.
- Deje que el ratón se seque del etanol. Evitar cualquier contacto del etanol con los órganos internos debido a la neurotoxicidad.
- Después de secar el mouse, colóquelo con alfileres en posición prona (boca abajo). Coloque los alfileres en cada extremidad trasera y delantera.
- Con fórceps, haga una incisión en la línea media que se extienda craneocaudalmente desde la parte posterior del cuello hasta la columna lumbar. A continuación, levante los colgajos dérmicos bilateralmente con pinzas y exponga el tejido subcutáneo.
- Palpar el cráneo del ratón hasta llegar a la unión craneocervical. Con unas tijeras perpendiculares al animal, corte los músculos cervicales y la columna vertebral en la unión craneocervical (la séptima vértebracervical), utilizando pinzas pesadas. Diseccionar la columna vertebral caudalmente y extirpar la columna vertebral con pinzas pesadas hasta alcanzar el nivel lumbar (nivel de las extremidades traseras).
- Realizar una transección caudal completa a nivel de la columna lumbar (5ª vértebra lumbar) utilizando pinzas pesadas.
- Pase el ratón por encima (boca arriba). No es necesario cubrir la incisión ya que el GRD se extrae de los niveles vertebrales inferiores y no de las cervicales.
- Cortar en la línea media desde el cuello hasta el abdomen, retraer la piel lateralmente y luego cortar para abrir el peritoneo.
- Extirpar los órganos internos del peritoneo (hígado, bazo, páncreas, estómago e intestino) en bloque. A continuación, extirpe los órganos retroperitoneales (es decir, los riñones y el páncreas). Cranealmente, abra la pared torácica.
- Con unas pinzas y una cuchilla quirúrgica, corte las costillas, dejando 5 mm de costillas bilateralmente lejos de la columna vertebral. En este punto, la columna vertebral se separa del resto del cuerpo.
- Lave la columna vertebral de la sangre con solución salina fresca (PBS) fría (4 °C) con solución salina fresca tamponada con fosfato (PBS) dos veces.