1. Preparación de materiales
- cubreobjetos para autoclave
- Coloque los cubreobjetos en un vaso de precipitados.
- Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio.
- Autoclave a 121 °C a 15 psi durante 20 min.
- Secar a 50 °C. Conservar a temperatura ambiente en una campana de cultivo.
- Preparación de la solución de fijación: 3% de paraformaldehído + 2% de sacarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS)
- A un frasco de vidrio de 1.000 ml, agregue 700 ml de PBS y 30 g de paraformaldehído.
cautela: El paraformaldehído es corrosivo, use guantes adecuados.
- Disuelva completamente el paraformaldehído calentándolo a 80 °C con un microondas.
cautela: Los vapores de paraformaldehído son tóxicos, use una mascarilla.
- Dejar a temperatura ambiente toda la noche.
- Añadir 20 g de sacarosa.
- Agregue PBS para hacer que el volumen total sea de 1 L.
- Alícuota en tubos de 50 mL. La solución de fijación puede almacenarse durante 3 años a -20 °C o durante 3 meses a 4 °C.
2. Irradiación
>PRECAUCIÓN: Manipule el irradiador de rayos X con cuidado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Examine las células bajo un microscopio de fase invertida. Confirme que las celdas están unidas al cubreobjetos y vivas.
- Irradie la placa con rayos X de 6 Gy (1,4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA).
- Incubar durante 72 h a 37 °C en una atmósfera que contenga 5% de CO2.
nota: El tiempo de incubación puede ser modificado de acuerdo con el diseño experimental
3. Fijación
- Aspirar los medios de cultivo del plato.
- Con unas tijeras, corte la punta de una micropipeta de 1.000 μL a 5 mm del extremo.
nota: La punta cortada ayuda a aplicar suavemente la solución de fijación.
- Con la punta de corte, agregue 1 ml de solución de fijación (preparada en el paso 1.2) al plato desde la pared lateral del plato.
nota: Este paso es sensible al tiempo y, por lo tanto, debe realizarse sin cambiar las puntas de las micropipetas cuando se manipulan varias muestras. La aplicación de la solución de fijación directamente en el fondo de la placa puede dañar las células.
- Coloque el plato en un plato de cultivo cuadrado. Agite suavemente el plato de cultivo cuadrado para distribuir uniformemente la solución de fijación sobre el cubreobjetos.
- Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
- Aspire la solución de fijación del plato.
- Agregue 2 mL de PBS al plato desde la pared lateral del plato.
nota: La aplicación de PBS directamente en el fondo de la placa puede dañar las células.
- Aspire el PBS del plato.
- Repita los pasos 3.7 y 3.8 dos veces.
nota: El plato se puede almacenar durante 1 semana a 4 °C con los cubreobjetos bañados en 2 mL de PBS.
>4. Tinción DAPI
- En un portaobjetos de vidrio, aplique 5 μL 1 μg/mL de reactivo de tinción DAPI.
nota: El reactivo de tinción DAPI es estable durante 6 meses cuando se almacena protegido de la luz a -20 °C o menos.
- Con un bisturí, retire el cubreobjetos del plato.
- Retira el exceso de PBS en el cubreobjetos tocando el borde del cubreobjetos con una toalla de papel.
- Monte el cubreobjetos boca abajo sobre la gota de reactivo de tinción DAPI en el portaobjetos de vidrio para que las células queden expuestas al reactivo de tinción DAPI.
nota: Este paso es urgente. El secado del reactivo de tinción DAPI puede dar lugar a una tinción subóptima.
- Las muestras pueden almacenarse durante 1 año a -20 °C.
