Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Preparación de andamio esofágico descelularizado
- Obtenga esófago porcino intacto en un matadero a partir de cerdos Landrace recién sacrificados que se utilizan para la producción de alimentos. Un solo esófago proporcionará andamios suficientes para aproximadamente 30 construcciones separadas.
nota: Debido al extenso y lento protocolo de esterilización requerido, normalmente vale la pena obtener y procesar un mínimo de 10 esófagos a la vez.
- Coloque inmediatamente el esófago recién extirpado en un recipiente estéril de 180 mL que contenga aproximadamente 150 mL de solución de povidona yodada al 10% durante 5 min para reducir cualquier carga microbiana contaminante. Transfiera el esófago a una segunda olla que contenga aproximadamente 100 mL de PBS estéril que contenga 200 UI/mL de penicilina, 200 μg/mL de estreptomicina y 1,25 μg/mL de anfotericina B.
- Vuelva a colocar la tapa del recipiente y transporte el esófago de vuelta al laboratorio a temperatura ambiente. Se pueden transportar dos o tres esófagos en cada contenedor, dependiendo de su tamaño.
- Una vez en el laboratorio, manipule el tejido en una campana de flujo laminar utilizando una técnica aséptica para minimizar la contaminación microbiana. Esterilice las pinzas, las tijeras y las hojas de bisturí sumergiéndolas durante 5 minutos en etanol al 70% y enjuagándolas con PBS estéril.
- Manipule el esófago con pinzas estériles. Con las tijeras, corte el esófago longitudinalmente. Enjuague el tejido colocando el esófago en un recipiente estéril de 180 ml que contenga aproximadamente 100 ml de PBS estéril y agitando suavemente para eliminar cualquier residuo.
- Limpie una tabla de disección de corcho rociándola generosamente con etanol al 70% y déjela secar.
- Retire el esófago del PBS y, con agujas estériles, sujete el esófago con alfileres a la tabla, con la superficie mucosa hacia arriba. Agarre la superficie mucosa en un extremo del esófago con pinzas estériles y retírela de la tabla. Esto separará la mucosa de la submucosa subyacente.
- A continuación, utilice una hoja de bisturí estéril para diseccionar el esófago longitudinalmente a lo largo de la lámina propia, retirando los clavos a medida que avanza la disección para permitir que la mucosa se levante.
- Retenga la mucosa disecada y deseche la submucosa subyacente.
- Cortar y desechar los 2 cm más proximales y distales de la mucosa, ya que hay un mayor número de glándulas submucosas y una lámina propia más gruesa en esas zonas, respectivamente.
- Use un bisturí para cortar el tejido restante en 5 cm2. Coloque todo el tejido cortado en una olla estéril de 180 ml que contenga aproximadamente 150 ml de PBS estéril y agite suavemente para enjuagar el pañuelo. Si se procesan más de cinco esófagos a la vez, puede ser necesario utilizar varias macetas para este y los tres pasos siguientes.
- Con pinzas estériles, transfiera el tejido cortado a un recipiente de 180 mL que contenga 150 mL de NaCl estéril 1 M, 200 UI/mL de penicilina, 200 μg/mL de estreptomicina y 1,25 μg/mL de anfotericina B. Incubar durante 72 h a 37 °C.
- Coloque el pañuelo en una olla nueva de 180 mL que contenga 150 mL de PBS estéril. El epitelio habrá comenzado a separarse visiblemente del tejido subyacente. Pele suavemente el epitelio que se desprende del esófago de cerdo con pinzas estériles y deséchelo.
- Coloque el pañuelo restante en una olla nueva de 180 ml y agregue 150 ml de PBS estéril. Agitar suavemente durante 5 minutos para lavar. Vierta el PBS y repita dos veces más con PBS fresco.
- Coloque todo el tejido en un frasco de vidrio de 500 ml que contenga 400 ml de solución estéril de glicerol al 80% (v/v) durante 24 h a temperatura ambiente. Transfiera a 400 mL de solución estéril de glicerol al 90% (v/v) durante 24 h más.
- Almacenar en 400 mL de solución estéril de glicerol al 100% a temperatura ambiente durante un mínimo de 4 meses para deshidratar y esterilizar el tejido preservando la integridad de la membrana basal.
