Extracción de exosomas basada en perlas magnéticas: una técnica para aislar exosomas específicos de biofluidos

Resumen

Fuente: Tu, M. et al. Detección de biomarcadores exosómicos mediante liberación y medición inducida por campo eléctrico (EFIRM). J. Vis. Exp. (2015)

En este video, demostramos un procedimiento para aislar exosomas de biofluidos objetivo utilizando microperlas magnéticas. El procedimiento permite la captura rápida de exosomas, que se pueden utilizar para el análisis posterior.

Protocolo

1. Extracción de exosomas basada en perlas magnéticas

1. Pipetear una solución bien mezclada de 5 μL de micropartículas magnéticas recubiertas de estreptavidina en 495 μL de tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un tubo de microcentrífuga para resuspender las perlas. Lave y vuelva a suspender las perlas con 500 μL de PBS tres veces utilizando una rejilla magnética. El bastidor es un conjunto de imanes en el lateral de una unidad de carcasa que puede contener los tubos de microcentrífuga de muestra.
   1. Para cada lavado, primero, deje reposar los tubos en la rejilla durante 1 minuto y luego use una punta de pipeta para eliminar con cuidado el tampón sobrenadante sin alterar las perlas.
   2. Coloque los tubos en una rejilla normal sin imanes en el lateral. Añada 500 μL de PBS en los tubos y utilice la pipeta para mezclar la solución y las perlas. A continuación, vuelve a colocar los tubos en la rejilla magnética para volver a separar las perlas de la solución.
   3. Realice esta eliminación del tampón a través de la magnetización y la resuspensión en PBS un total de tres veces. Esto realiza un lavado inicial de las partículas magnéticas.
2. Vuelva a suspender las perlas en 490 μL de tampón PBS, colocando el tubo en la parte no magnetizada de la rejilla magnética. Pipetear 5 μL de anticuerpo anti-humano CD63 biotinilado de ratón a una concentración de stock de 1,0 mg/mL en la mezcla de perlas. Utilice la pipeta para mezclar las perlas y el anticuerpo en la solución.
3. Coloque los tubos de microcentrífuga con una mezcla de perlas y anticuerpos biotinilados en un rotador de muestras. Ajuste los parámetros del rotador para el rotador de muestras para la rotación recíproca a 90°, con una inclinación de 5 s y una vibración de 5° durante 1 s. Gire los tubos de mezcla de muestra y perlas a estos parámetros durante 30 minutos en RT.
4. Eliminar el anticuerpo no unido después de la conjugación.
   1. Después de 30 minutos de rotación en RT, vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética durante 5 minutos.
   2. Realizar tres lavados de perlas eliminando la fase líquida con una micropipeta y lavar con 500 μL de PBS. Después del triple lavado, vuelva a suspender las perlas en 490 μL de caseína-PBS y colóquelas en la parte no magnetizada de la rejilla.
5. Extracción de exosomas mediante perlas recubiertas de anticuerpos.
   1. Etiquete cada tubo con la identificación de la muestra objetivo. Pipetee una muestra de 10 μl de suero o saliva en el tubo de microcentrífuga. Utilice la pipeta para mezclar la muestra y las perlas magnéticas pipeteando varias veces.
   2. Coloque los tubos con muestras y perlas de anticuerpos CD63 antihumanos en el rotador y gírelos durante 2 h en RT. Utilice los mismos parámetros del rotador que se describen en el paso 1.3.
   3. Después de 2 h de rotación de la muestra, realice un triple lavado magnetizando para separar las perlas de la solución, eliminando la fase líquida con una micropipeta y resuspendiendo las perlas en 500 μL de tampón Tris-HCl. Las perlas resultantes ahora están unidas a los exosomas y están listas para la liberación y medición del campo eléctrico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo CD63 biotinilado	Ancell, Estados Unidos	215-030
Dynabeads MyOne Estreptavidina T1	Invitrogen, Estados Unidos	65601
Magnetismo de neodimio (1/10" de diámetro x 1/32" de grosor)	K&J Magnetics, Estados Unidos	DH101
Agua destilada ultrapura	Life Technologies, Estados Unidos	10977-023
Anti-Fluoresceína-POD, Fab fragmentos	Roche, Alemania	11426346910
Solución salina tamponada con fosfato	Life Technologies, Estados Unidos	10010023
Caseína/PBS	Fisher Scientific, Estados Unidos	37532