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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Digestión de tejidos
- Usando una placa de cultivo de tejidos de 100 mm, pique mecánicamente el tejido en pedazos finos de ~1-2 mm de tamaño usando tijeras de disección esterilizadas en autoclave y pinzas quirúrgicas (Figura 1B, C). El tejido conectivo entre las piezas debe cortarse para garantizar una separación adecuada y facilitar los pasos posteriores.
- Añadir 6 mL de la solución de dispasa/colagenasa al tejido picado. A continuación, incubar a 37 °C durante aproximadamente 30 min a 1 h.
- Perforar el tejido pipeteando con una pipeta serológica de 5 ml de 15 a 20 veces.
- Incubar a 37 °C durante otros 30 minutos a 1 hora.
- Repita los pasos 1.3 y 1.4 dos o tres veces más o hasta que el tejido se asemeje a una suspensión y pueda pasar fácilmente a través de la abertura de la pipeta (Figura 1D).
nota: El tamaño inicial de la muestra de tejido y la finura de la picadura del tejido determinarán cuántas veces es necesario repetir los pasos 1.3 y 1.4. Por lo general, recibimos tejido de aproximadamente 1 cm x 1 cm de tamaño. Además, se puede monitorear la disociación del tejido utilizando un microscopio de cultivo de tejido invertido estándar para rastrear el progreso de la disociación celular del tejido. Los pequeños grupos de células son ideales para el crecimiento inicial de las células salivales como salisferas.
>2. Recubrimiento de pozos con matriz de membrana basal
NOTA: La matriz de membrana basal (BMM) debe descongelarse durante la noche a 4°C el día antes de su uso. Una vez descongelado, el BMM debe mantenerse constantemente en hielo o a 4 °C, ya que se solidificará rápidamente (es decir, formará un gel) a temperaturas más cálidas. Además, se debe tener cuidado si las muestras se han enfriado en hielo antes de colocarlas en BMM, ya que las muestras frías "derretirán" el BMM y expondrán las células al plato de plástico.
- Pipetee lentamente BMM (consulte la Tabla de materiales) en cada pocillo que se va a recubrir. Distribuya uniforme y lentamente el BMM sobre el pozo.
NOTA: Por lo general, utilizamos 500 μL por cada pocillo de una placa de 6 pocillos, pero este volumen se puede ajustar para su uso en otras variantes de placas, como 12 pocillos o 24 pocillos, o según se desee para hidrogeles más gruesos o más delgados.
- Incube las placas recubiertas a 37 °C durante al menos 15 minutos antes de usarlas para permitir que el BMM tenga tiempo de solidificarse.
>3. Filtrado de tejido no digerido, lisis de glóbulos rojos y placas celulares
- Transfiera el homogeneizado de tejido del paso 1.5 a un tubo cónico de 15 mL. Lave la placa una vez con 6 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco para transferir las células restantes.
- Filtre el homogeneizado en un tubo cónico de 50 ml a través de un colador de células de malla de nailon de 70 μm para eliminar el tejido no digerido. Centrifugar las células coladas durante 5 min a 500 x g.
- Diluya 10 tampones de lisis RBC en dH2O estéril para hacer una solución de trabajo 1x.
- Aspirar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet de célula en 10 mL de 1x tampón de lisis RBC. Incubar durante 5 min a 37°C.
- Agregue 20-25 mL de DPBS para neutralizar el tampón de lisis de glóbulos rojos y minimizar la lisis de las células salivales. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
nota: Después del tratamiento con tampón de lisis de glóbulos rojos, la pastilla celular debe ser blanca. El color rojo en el pellet indica que no todos los glóbulos rojos se han lisado por completo. Repita los pasos 3.4 a 3.5 si es necesario para la lisis completa de todos los glóbulos rojos.
- Aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 1-2 mL de BEGM por pocillo, luego coloque las celdas resuspendidas en pocillos recubiertos con BMM. Incubar a 37°C.
- Una vez colocadas en BMM, las células se formarán en estructuras esféricas o "salisferas" durante un período de 2 a 3 días. Las células pueden mantenerse como salisferas durante unos 5-7 días antes de que el BMM comience a degradarse, lo que permite que las células accedan y se adhieran al plástico y crezcan como una monocapa.