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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de CTCs
- Calcular el número de CTC necesarias para la inyección y preparar una suspensión unicelular a 1,0 × 104 células/μL en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Coloque la suspensión celular sobre hielo o a 4 °C durante todo el procedimiento.
nota: Cuando use líneas celulares que requieran tripsinización, asegúrese de lavar las células dos veces con PBS estéril para eliminar la tripsina. Realice el recuento de células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Si se utiliza una cohorte grande (>50 ratones), se debe volver a contar las células y validar la viabilidad celular entre inyecciones para asegurarse de que se administra un número constante de células por ratón.
>2. Procedimiento prequirúrgico
- Inyectar al ratón por vía subcutánea 5 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida (Bup-SR).
nota: No inyecte el área de la incisión propuesta; Elija un lugar de inyección lejos de la escápula.
- Anestesiar al ratón con isoflurano al 2-3% hasta que no muestre signos del reflejo de enderezamiento. Además, compruebe el reflejo de pellizco de la cola y/o la pata para confirmar el estado de anestesia.
- Prepare el ratón para la cirugía en un lugar alejado del área de operaciones. Corte el sitio quirúrgico (es decir, la superficie dorsal del cráneo) con suficiente área de borde para evitar que el pelaje contamine el sitio de la incisión; Luego, sature el sitio con antiséptico germicida para la piel, trabajando desde el centro del sitio hasta la periferia, y luego deje secar. Aplique un paño estéril o un material de paño de plástico estéril con respaldo adhesivo para proteger el sitio quirúrgico de la contaminación.
nota: Los instrumentos deben esterilizarse en autoclave con anticipación y las puntas deben volver a esterilizarse entre animales utilizando un esterilizador de perlas de vidrio.
- Afeitar el pelaje de toda la superficie ventral de la cabeza y preparar la piel mediante la técnica estéril.
- Coloque la nariz con un cono nasal modificado en forma de L del aparato estereotáctico, asegurándose de que las narinas permanezcan claras y abiertas. Con cinta adhesiva a través de las superficies ventrales de ambos pabellón auricular, tire suavemente de la piel hacia adelante para asegurarla al cono de la nariz y doble el cuello en un ángulo de aproximadamente 90 ° una vez asegurado. Administrar isoflurano al 1,5% para mantener la anestesia.
nota: La posición adecuada dará como resultado que el área de la incisión se presente de una manera que permita la fácil identificación de la cresta caudal del hueso occipital.
- Coloque el cuerpo para asegurarse de que la columna vertebral se mantenga nivelada con la cisterna magna y, mientras aplica una ligera tracción a la cola, coloque cinta adhesiva en la base de la cola para asegurarla.
>3. Cisterna Quirúrgica Magna Inyección
- Con el cuello en completa extensión, y comenzando justo entre las pinnas, pase las puntas de las tijeras quirúrgicas hacia abajo con una ligera presión a través del hueso occipital.
nota: Mientras se está en esta posición de línea media, se nota una pequeña depresión cuando las puntas de las tijeras se sumergen en el área cóncava sobre la cisterna magna.
- Haga una pequeña incisión de 3 a 5 mm en la línea media justo por encima de la concavidad palpada. Extraiga 5 μL de suspensión de células a 1,0 × 104 células/μL (total de 5,0 × 104 células) en una jeringa Hamilton de 30 G.
- Use pinzas de punta roma con puntas de 1-2 mm para presionar suavemente la cisterna magna. Introduzca las puntas en posición cerrada y ábralas mientras aplica presión hacia abajo sobre la duramadre.
- Repita la disección roma descrita en el paso anterior hasta que la membrana dural se identifique fácilmente y los vasos sanguíneos asociados sean visibles en el área expuesta.
nota: La ventana de inyección resultante garantiza que los vasos sanguíneos no se dañen durante la inserción de la aguja.
- Mientras mantiene las pinzas abiertas para retraer la musculatura circundante, introduzca una aguja de 30 G debajo de la duramadre para visualizar el bisel. Asegúrese de que la aguja solo se introduzca justo más allá del bisel. Despliega lentamente un émbolo de jeringa y administra las células justo debajo de la duramadre.
- Coloque correctamente el bisel para observar la inyección debajo de la duramadre. Administre cuidadosamente la técnica y utilice la aguja no perforante de 30 G para evitar daños en la membrana y garantizar una fuga mínima. Si se notan fugas, aplique una presión suave con un aplicador con punta de algodón.
- Cierre la piel aplicando una pinza para heridas o una microgota de adhesivo cutáneo. Una vez que la inyección se haya realizado con éxito, permita que los ratones se recuperen de la anestesia en una manta caliente, observándolos continuamente hasta que puedan mantener la posición esternal y demostrar un movimiento intencionado.
- Monitoree a los ratones diariamente después de la cirugía durante la primera semana. Si un ratón parece tener dolor o angustia, trátelo con una inyección subcutánea de 10 mg/kg de carprofeno una vez cada 12 a 24 horas durante un máximo de 5 días, según la consulta veterinaria y las directivas. Permita que los ratones se recuperen y monitoree durante al menos 48 a 72 horas antes >nota: Bup-SR, administrado de forma preventiva, durará hasta 72 h, por lo que normalmente no son necesarios analgésicos adicionales. Sin embargo, a los animales se les proporcionarán analgésicos adicionales según sea necesario (si están letárgicos, no comen, están irritados). Si un sitio quirúrgico presenta signos de infección postoperatoria (es decir, enrojecimiento, hinchazón, sensibilidad, alodinia, hiperalgesia, hiperpatía o supuración), o si el ratón está protegiendo el área afectada, eutanasiar al ratón. Si las células cancerosas se inyectan con éxito en el LCR, la LMD y la progresión tumoral se desarrollarán en el SNC en 1 o 2 semanas (dependiendo de los tipos de CTC o de la línea celular utilizada) (Figura 1).
