Inyección intracerebroventricular en ratón: un método de administración directa de fármacos mediado por ommayas para administrar fármacos a los ventrículos cerebrales del cerebro de ratón

Resumen

Fuente: Law, V. et al. Un modelo de xenoinjerto de ommayas murinos para estudiar la terapia dirigida directa de la enfermedad leptomeníngea. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra la inyección intracerebroventricular mediada por ommaya en un modelo de ratón. El método permite la administración localizada de posibles candidatos a fármacos y evade la barrera hematoencefálica.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Ensamblaje e implantación de Ommayas Murinos

1. Preparación de la estación
   1. Desinfectar la superficie de la estación. Coloque una cubierta azul sobre la superficie y tenga a mano todas las herramientas y suministros esterilizados indicados en la Figura 1.
2. Procedimiento prequirúrgico
   1. Aplicar analgesia (Bup-SR) y mantener un ambiente quirúrgico estéril.
3. Implante quirúrgico de Ommaya Murino
   1. Ensamble el dispositivo de inyección Murine Ommaya utilizando un puerto de inyección en miniatura de 25G (0,51 mm de diámetro exterior) y un disco espaciador de 1 mm. Utilice un adhesivo estéril de cianoacrilato para asegurar la penetración de aproximadamente 2,5 mm de la cánula metálica en el hemisferio cerebral derecho (Figura 2A-C)
      nota: En este laboratorio se desarrolló un prototipo de Mouse Ommaya compatible con resonancia magnética, que ya tiene ambas partes (puerto de inyección en miniatura y espaciador) impresas en 3D juntas como una sola unidad (Figura 2D). La versión de una sola unidad fue probada por resonancia magnética y puede ahorrar tiempo al eliminar el paso de montaje.
   2. Anestesiar al ratón con isoflurano al 2-3% hasta que no haya signos del reflejo de enderezamiento. Además, verifique el reflejo de pellizco de la cola y/o la pata para confirmar el estado de anestesia.
   3. Afeitar toda la superficie ventral de la cabeza de pelo y preparar la piel según la técnica estéril. Coloque el ratón en el aparato estereotáctico con un cono nasal para continuar la administración de isoflurano durante el procedimiento; Disminuya el isoflurano al 1,5%. Apriete suavemente las barras de los oídos para asegurar la cabeza y aplique lubricante ocular para cubrir los ojos del ratón.
   4. Hacer una pequeña incisión en la piel (3 mm), seguida de una disección roma de los tejidos subcutáneos subyacentes para exponer el cráneo. Seca el cráneo con palitos aplicadores con punta de algodón empapados en peróxido de hidrógeno.
   5. Taladre un orificio de rebaba en el cráneo de 0,5 mm posterior y 1,1 mm lateral del bregma, el punto anatómico del cráneo donde la sutura coronal se cruza perpendicularmente por la sutura sagital (Figura 2A), así como un orificio de rebaba de 0,9 mm para exponer la duramadre. Retire el microtaladro a un lado y marque suavemente el hueso que rodea inmediatamente el orificio de la fresa antes de insertar un puerto de inyección (profundidad de aproximadamente 2,5 mm), fijado al cráneo con un adhesivo estéril de cianoacrilato. Sutura de estado alrededor del punto de inyección utilizando suturas de nailon 4-0 sin absorbancia en un patrón de sutura interrumpida o sutura de hilo de bolsa.
   6. Aloje a los ratones postoperatorios en jaulas individuales para la recuperación de la cirugía.
      nota: Es posible que el Ommaya Murino se desprenda cuando varios ratones recuperados de la cirugía se alojan en la misma jaula, posiblemente debido a las constantes interacciones de manipulación. Se recomienda que los ratones implantados con Murine Ommaya se alojen individualmente (o no más de 2 ratones por jaula) durante el transcurso del ensayo de eficacia del fármaco.

>2. Tratamiento de los Ommayas Murinos

1. Dosificación de ratones con el Ommaya Murino
   1. Anestesiar al ratón con isoflurano al 2-3%, hasta que no haya signos de reflejo de enderezamiento. Además, verifique el reflejo de pellizco de la cola y/o la pata para confirmar el mantenimiento de la anestesia.
   2. Acceda al Murine Ommaya usando un adaptador de inyección de puerto y una jeringa Hamilton. Con pinzas, sujete la parte superior del puerto de inyección en miniatura e inserte suavemente el adaptador del inyector del puerto completamente en el tabique del puerto.
      nota: El inyector de puerto perfora el tabique del puerto de una manera que reduce el espacio muerto al mínimo y permite la inyección controlada a través de una bomba de jeringa motorizada (Figura 3A). Los tratamientos dirigidos/novedosos se inyectan a un caudal de 1 μL/min bajo anestesia. El tratamiento se administrará a intervalos especificados (diario/semanal) durante un tiempo determinado (semanas/meses), según el criterio del investigador.
      Un volumen entre 3 y 7 μL es óptimo, ya que un volumen <3 μL no es fiable y un volumen >7 μL puede causar demasiada presión. El tamaño de la jeringa Hamilton puede oscilar entre 10 y 100 μL, dependiendo del número de ratones en cada brazo de tratamiento. La precarga del volumen adecuado en la jeringa Hamilton evitará el reemplazo repetido de la jeringa, minimizando así los errores. Lo mejor es dedicar 1 jeringa Hamilton por brazo de tratamiento.
   3. Una vez realizada la inyección, separe el Murine Ommaya del adaptador de inyección del puerto con pinzas y devuelva el ratón a la jaula para recuperarse de la anestesia.

Resultados

Figura 1: Un ejemplo de la configuración de una estación de trabajo para realizar la implantación de Murine Ommaya en ratones. (1) Máquina de anestesia de gas/vaporizador. (2) Cortina de papel azul estéril que cubre un soporte estereotáxico. (3) Dispositivo estereotáxico (soporte/escenario, barras para los oídos, cono nasal). (4) Microtaladro. (5) Lupa con luz. (6) Barras aplicadoras estériles con punta de algodón con recipiente de enjuague con solución...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Disco espaciador de 1 mm	Alzet, Corporación Durect	#0008670	Solo disco espaciador
4-0 Sutura de nailon Ethilon	Cualquier proveedor
Bombas de jeringa automáticas	Bombas de jeringa Harvard (o cualquier proveedor)	#70-4505	Bomba 11 Elite
Esterilizador de perlas	Braintree Scientific Inc. (o cualquier proveedor)	#GER 5287-120V	Germinador 500
Buprenorfina de liberación sostenida (Bup-SR)	Zoopharm		Controlado por la DEA
Adhesivo estéril de cianoacrilato	Cualquier proveedor
Sistema de anestesia por inhalación de gas	VeteEquip	#901812	COMPAC5
Jeringas de microlitros Hamilton	Hamilton		10, 25, 50 y 100 μL; 30G para inyección de cisterna magna
Peróxido de hidrógeno	Cualquier proveedor
Sistema de imagen IVIS 200	Ciencias de la vida de Caliper
Lupa con luz	Cualquier proveedor
Microtaladro	Stoelting (o cualquier proveedor)	#51555M
Imágenes por resonancia magnética	Bruker	Serie BioSpec	opcional
Prototipo de Murine Ommaya (compatible con resonancia magnética)	Laboratorios Instech, Inc.	#VAB620-25MRI-3.3
Inyector PinPort	Laboratorios Instech, Inc.	#PNP3M-50
PinPort	Laboratorios Instech, Inc.	#1-PNP3F28-50
Instrumentos quirúrgicos para roedores (tijeras, fórceps)	Instrumento quirúrgico Roboz (o cualquier proveedor)
Dispositivo estereotáxico	Stoelting (o cualquier proveedor)	#51730M
Papel azul estéril / cubierta de cortina	Cualquier proveedor
Palitos de algodón estériles	Cualquier proveedor

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