Modelo de células madre de glioma marcadas con luciferasa: un método mediado por lentivirus para preparar células madre de glioma marcadas con luciferasa para estudios terapéuticos in vitro

Resumen

Fuente: Hu, Z. et al. Un flujo de trabajo de cribado rápido para identificar posibles terapias combinadas para el GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra el establecimiento de células madre de glioma marcadas con luciferasa a través de la administración de genes mediada por lentivirus. La luciferasa actúa como un gen reportero y ayuda a facilitar los experimentos rápidos de detección de fármacos.

Protocolo

>1. Preparación de GSCs marcadas con luciferasa

1. Comience con el cultivo de GSC y centrifuga a 70 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
2. Retirar el sobrenadante y digerir las células con accutasa durante 4 min a 37 °C. Utilice una punta de 200 μL y pipetee repetidamente para disociar y volver a suspender el pellet celular.
3. Diluya las células a 2 x 10⁵ células por pocillo en una placa de cultivo de 12 pocillos y cultive las células durante la noche.
4. Añadir 30 μL de sobrenadante del virus luciferasa-EGFP (título >10⁸ TU /mL) en cada pocillo de la placa y luego centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 h a 25 °C. Cultivar las células durante la noche.
5. Refresque el medio al día siguiente y cultive las células durante otras 48 h.
6. Observe las células bajo un microscopio fluorescente para confirmar la apariencia de las células GFP positivas.
7. Utilice un clasificador de celdas de flujo para clasificar y seleccionar las GSC con alta fluorescencia GFP para seguir cultivando las células.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
B-27	Gibco	17504-044	50 veces
FEAG	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicilina-Estreptomicina	HyClone	SV30010	P: 10.000 unidades/ml S: 10.000 ug/ml
Piruvato de sodio	Gibco	2088876	100 mM