Ensayo basado en bioluminiscencia celular: un método de alto rendimiento para el cribado combinatorio de fármacos

Abstract

Fuente: Hu, Z. et al. Un flujo de trabajo de cribado rápido para identificar posibles terapias combinadas para el GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente.J. Vis. Exp.(2021)

En este video, describimos un método que destaca la utilidad del ensayo de bioluminiscencia para el cribado sensible y rápido de fármacos. Estos fármacos pueden probarse solos o en combinación para evaluar la sinergia en su modo de acción.

Protocol

1. Medición de la viabilidad celular basada en la bioluminiscencia

1. Recubrimiento de placas con la mezcla de matriz extracelular (ECM) (p. ej., Matrigel): Añadir 40 μL de mezcla de ECM de 0,15 mg/mL a cada pocillo e incubar la placa durante 1 h a 37 °C. Retirar el exceso de mezcla de ECM y enjuagar suavemente una vez con PBS.
2. Agregue 100 μL de medio de cultivo que contenga 15,000, 10,000, 8,000, 6,000, 4,000, 2,000, 1,000 y 500 celdas XG387-Luc junto con 100 μL de medio en blanco como control en cada pocillo para 6 réplicas en una placa inferior óptica de 96 pocillos y cultive las celdas durante la noche a 37 °C.
3. Retirar el sobrenadante, añadir 50 μL de medio de cultivo que contenga 150 ng/μL de D-luciferina en cada pocillo e incubar las células durante 5 min a 37 °C.
4. Tome imágenes de la bioluminiscencia celular en la placa utilizando el sistema de imágenes de espectro IVIS. Utilice el software incorporado para crear múltiples áreas circulares de la región de interés (ROI) y cuantificar la bioluminiscencia celular.

>2. Tratamiento con temozolomida y cribado combinado

1. Precubra cuatro placas de 96 pocillos como se describe anteriormente en el paso 1, antes del tratamiento.
2. Siembre células XG387-Luc a una densidad de 1.000 células en un medio de cultivo de 100 μL en cada pocillo de una placa inferior óptica de 96 pocillos y cultive las células durante la noche.
3. Prepare con antelación la temozolomida y los agentes objetivo a partir de la solución madre. Prepare una serie de concentraciones compuesta por 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM y 50 μM de temozolomida en medio de cultivo para el tratamiento con agente único. Diluir la temozolomida y los agentes dirigidos en una solución madre en el medio de cultivo, respectivamente, para obtener concentraciones finales de 200 μM y 2 μM para el cribado combinado de fármacos (lista de materiales).
4. Retire el medio de cultivo cuando la mayoría de las GSC se adhieran a la parte inferior de las placas; agregue el medio preparado anteriormente que contenga temozolomida en cada pocillo para obtener tres réplicas técnicas por tratamiento.
5. Para tratar la temozolomida y examinar las combinaciones de fármacos, se debe extraer el medio en blanco y añadir el medio preparado anteriormente que contenga 200 μM de temozolomida o 2 μM de agente dirigido, o una combinación de ambos, en cada pocillo para obtener tres réplicas técnicas por tratamiento.
6. Incubar todas las placas a 37 °C, 5% de CO₂ durante 3 días.
7. Retire el medio que contiene el fármaco, añada 50 μL de medio en blanco que contenga 150 ng/μL de D-luciferina en cada pocillo e incube las células durante 5 min a 37 °C.
8. Tome imágenes de la bioluminiscencia celular en la placa utilizando el sistema de imágenes de espectro IVIS. Utilice el software incorporado para crear múltiples ROI circulares y cuantificar la bioluminiscencia celular.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	17504-044	50 veces
FEAG	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicilina-Estreptomicina	HyClone	SV30010	P: 10.000 unidades/ml S: 10.000 ug/ml
Piruvato de sodio	Gibco	2088876	100 mM
ABT-737	MCE		Selectivo e imitador de BH3 Bcl-2, Bcl-xL e inhibidor de Bclw
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Inhibidor de Wee1
Axitinib	MCE		Inhibidor de la tirosina cinasa multidirigido
AZD5991	MCE		Inhibidor de Mcl-1
Un 83-01	MCE		Potente inhibidor de la quinasa ALK5 del receptor tipo I de TGF-β
CGP57380	Selleck		Potente inhibidor de MNK1
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Doble inhibidor de PI3K y mTOR competitivo en ATP
Dasatinib	MCE		Inhibidor dual de la tirosina quinasa de la familia Bcr-Abl y Src
Erlotinib	MCE		Inhibidor de la tirosina cinasa EGFR
Gefitinib	MCE		Inhibidor de la tirosina cinasa EGFR
Linifanib	MCE		Inhibidor multidiana de la familia VEGFR y PDGFR
Masitinib	MCE		Inhibidor de c-Kit
ML141	Selleck		Inhibidor no competitivo de la GTPasa Cdc42
OSI-930	MCE		Inhibidor multidiana de Kit, KDR y CSF-1R
Palbociclib	MCE		Inhibidor selectivo de CDK4 y CDK6
SB 202190	MCE		Inhibidor selectivo de la quinasa p38 MAP
Bromuro de sepantronio (YM-155)	MCE		Inhibidor de Survivin
TCS 359	Selleck		Potente inhibidor de FLT3
UMI-77	MCE		Inhibidor selectivo de Mcl-1
4-Hidroxitamoxifeno (Afimoxifeno)	Selleck		Modulador selectivo del receptor de estrógeno (RE)