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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de suspensión unicelular del cerebro
- Divida el medio de gradiente de densidad en una proporción de 9:1 con PBS en un tubo cónico de 15 mL para producir una solución final al 100%.
- Anestesiar ratones en el pico de EAE con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg) y perfundir intracardíacamente con 20 mL de PBS estéril helado. Para lograrlo, inyecte PBS de manera lenta y constante en el ventrículo izquierdo del corazón con una jeringa de 20 ml y abra la aurícula derecha.
- Corte el cráneo con cuidado desde la nariz hasta el cuello, luego extraiga el cerebro de la caja craneal en 10 mL de RPMI en tubos cónicos de 50 mL. Mezclar bien para eliminar los glóbulos rojos adheridos. A continuación, retire el medio por aspiración y añada 10 mL de RPMI.
- Coloque los sesos y el medio en un plato de 100 mm. Picar finamente con una cuchilla de afeitar.
- Transfiera 6 mL de la placa a un homogeneizador de vidrio sinterizado de 7 mL helado con una pipeta limpia. Evite dejar grandes cantidades de tejido en la pipeta. Una pequeña cantidad es inevitable.
- Muele el cerebro con el émbolo "suelto" del mortero primero, luego usa el émbolo "apretado" hasta que la suspensión sea homogénea y vierte en un tubo cónico preenfriado de 15 mL y mantenlo en hielo.
- Después de homogeneizar todas las muestras, estime el volumen. Ajuste el volumen con RPMI a 7 mL. A continuación, coloque 3 mL de matriz de membrana basal 100% helada en un tubo de centrífuga cónico refrigerado de 15 mL y añada 7 mL de homogeneizado cerebral para obtener un medio de gradiente de densidad final del 30%. Mezclar por inversión un par de veces. No haga vórtice.
- Para garantizar una interfaz nítida, añada con cuidado y lentamente 1 mL de medio de gradiente de densidad de capa subyacente del 70% en RPMI con una pipeta de 3 mL.
- Centrifugar a 800 x g durante solo 20 minutos a 4 °C. Ajuste la aceleración a 1 y la deceleración a 0. Después de la centrifugación, aspirar casi toda la fase superior, teniendo cuidado de eliminar completamente la mielina en la parte superior (Figura 1).
- Retire la interfaz en un nuevo tubo de centrífuga 15. Ajuste el volumen a 10 mL con RPMI.
- Centrifugar a 500 x g durante 10 min. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en ~200 μL de tampón de tinción por citometría de flujo (FSC).
