$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Cultivo primario de microglía/macrófagos
- Cultivo primario de microglía
- Cultivo de microglía primaria de rata comercial (2 x 106 células) (ver la Tabla de Materiales) en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero libre de exosomas, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 9,0 g/L de glucosa a 37 °C y 5% de CO2.
- Recoja el medio acondicionado después de un cultivo de 48 h y proceda al aislamiento de los EV.
- Cultivo primario de macrófagos
- Cultivo de macrófagos primarios comerciales de rata (1 x 106 células) en el medio proporcionado por el fabricante (véase la tabla de materiales) a 37 °C y 5% de CO2, con suero libre de exosomas.
- Recoja el medio acondicionado después de un cultivo de 24 h y proceda al aislamiento de los EV.
>2. Aislamiento de vehículos eléctricos
- Preaislamiento de vehículos eléctricos a partir de medio acondicionado
- Transfiera el medio de cultivo condicionado de los cultivos de microglía o macrófagos (pasos 1.1.2 o 1.2.2) a un tubo cónico.
- Centrifugar a 1.200 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) para peletizar las células.
- Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico. Centrifugar a 1.200 x g durante 20 min a RT para eliminar los cuerpos apoptóticos.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo de policarbonato de 10,4 mL y transfiera el tubo a un rotor de 70,1 Ti. Ultracentrífuga a 100.000 x g durante 90 min a 4 °C para pellet los EV.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet que contiene EV en 200 μL de solución salina tampón de fosfato filtrado (PBS) de 0,20 μm.
- Aislamiento de vehículos eléctricos
- Preparación de la columna casera de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
- Vacíe una columna de cromatografía vítrea (longitud: 26 cm; diámetro: 0,6 cm) (consulte la Tabla de materiales), lávela y esterilícela.
- Coloque un filtro de 60 μm en la parte inferior de la columna.
- Apile la columna con una matriz base de filtración de gel de agarosa reticulada para crear una fase estacionaria de 0,6 cm de diámetro y 20 cm de altura.
- Enjuague la fase con 50 mL de PBS filtrado de 0,20 μm. Almacenar a 4 °C para utilizarlo posteriormente si es necesario.
- Coloque el pellet EV resuspendido encima de la fase estacionaria de la columna SEC.
- Recoja 20 fracciones secuenciales de 250 μL mientras continúa agregando PBS filtrado de 0,20 μm en la parte superior de la fase estacionaria para evitar el secado de la columna. Almacene las fracciones a -20 °C si es necesario.
nota: Se puede realizar un almacenamiento más largo de una semana a -80 °C para mantener la integridad del EV para el análisis molecular.