Extracción basada en SDS-PAGE de proteínas asociadas a vesículas extracelulares: un procedimiento para extraer proteínas de EV y prepararlas para la digestión en gel

Resumen

Fuente: Lemaire, Q. et al. Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunitarias y estudio del impacto funcional en el entorno celular. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos el método de digestión en gel SDS-PAGE para la extracción de proteínas de vesículas extracelulares o EV. Una vez aislados, los fragmentos de proteína obtenidos se pueden utilizar para el análisis proteómico.

Protocolo

1. Caracterización de los vehículos eléctricos

1. Análisis de Western Blot
   1. Extracción de proteínas
      1. Aísle los EV mediante una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y cuantifique mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA).
      2. Mezclar 50 μL de tampón RIPA (150 mM de cloruro de sodio [NaCl], 50 mM de Tris, 5 mM de etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético [EGTA], 2 mM de ácido etilendiamina-tetraacético [EDTA], 100 mM de fluoruro de sodio [NaF], 10 mM de pirofosfato de sodio, 1% de Nonidet P-40, 1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo [PMSF], 1x inhibidor de la proteasa) con la muestra de EV (25 μL resultante de la concentración de EV en el filtro) durante 5 min en hielo para proteínas de extracción.
      3. Sonicado durante 5 s (amplitud: 500 W; frecuencia: 20 kHz), 3 veces en hielo.
      4. Eliminar los restos vesiculares por centrifugación a 20.000 x g durante 10 min, a 4 °C.
      5. Recoja el sobrenadante y mida la concentración de proteínas con el método de ensayo de proteínas de Bradford.
   2. Electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y Western blot
      1. Mezclar extractos de proteínas (30 μg) con tampón de muestra Laemmli 5c (v/v).
      2. Cargue la mezcla de proteínas en un gel de poliacrilamida al 12%.
      3. Migre las proteínas del gel con tampón TGS (25 mM de Tris pH 8,5, 192 mM de glicina y 0,1% de SDS), a 70 V durante 15 min y 120 V durante 45 min.
      4. Transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa con sistema semiseco a 230 V durante 30 min.
      5. Saturar la membrana durante 1 h a RT con tampón de bloqueo (0,05% Tween 20 p/v, 5% leche en polvo p/v en 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Incubar la membrana durante la noche a 4 °C con anticuerpo monoclonal de ratón anti-proteína de choque térmico humano 90 (HSP90) diluido en tampón de bloqueo (1:100).
      7. Lave la membrana tres veces con PBS-Tween (PBS, 0.05% Tween 20 w/v) durante 15 min.
      8. Incubar la membrana durante 1 h en RT con anticuerpo secundario IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante de cabra diluido en tampón de bloqueo (1:10.000).
         NOTA: Un control negativo se realiza utilizando solo un anticuerpo secundario.
      9. Repita el paso de lavado (paso 1.1.2.7).
      10. Revele el kit de sustrato de Western blot de membrana con quimioluminiscencia mejorada (ECL) (consulte la tabla de materiales).

>2. Análisis proteómico

1. Extracción de proteínas y digestión en gel
   1. Aísle los EV mediante una columna de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y cuantifique mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Repita el paso 1.1.1 para la extracción de proteínas EV.
   2. Realice la migración de proteínas en el gel de apilamiento de un gel de poliacrilamida al 12%.
   3. Fije las proteínas en el gel con azul Coomassie durante 20 min en RT.
   4. Extirpa cada pieza de gel de color y córtala en trozos pequeños de 1 mm³.
   5. Lavar las piezas de gel sucesivamente con 300 μL de cada solución: agua ultrapura durante 15 min, acetonitrilo 100% (ACN) durante 15 min, bicarbonato amónico 100 mM (NH₄HCO₃) durante 15 min, ACN: 100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) durante 15 min, y 100% ACN durante 5 min con agitación continua.
   6. Seque completamente las piezas de gel con un concentrador de vacío.
   7. Realizar la reducción de proteínas con 100 μL de 100 mM de NH₄HCO₃ que contiene 10 mM de ditiotreitol durante 1 h a 56°C.
   8. Realice la alquilación de proteínas con 100 μL de 100 mM de NH₄HCO₃ que contenga 50 mM de yodoacetamida durante 45 min en la oscuridad en RT.
   9. Lavar las piezas de gel sucesivamente con 300 μL de cada solución: 100 mM de NH₄HCO₃ durante 15 min, ACN: 20 mM de NH₄HCO₃ (1:1, v/v) durante 15 min, y 100% ACN durante 5 min con agitación continua.
   10. Seque completamente las piezas de gel con un concentrador de vacío.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
acetonitrilo	Productos químicos de Fisher	A955-1
Bicarbonato de amonio	Sigma-Aldrich	9830
Anticuerpo HSP90 α/β (RRID: AB_675659)	Santa Cruz	SC-13119
Concentrado de reactivo de colorante de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bradford)	Bio-Rad	5000006
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43819
Ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N",N'-tetraacético	Sigma-Aldrich	03777-10G
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	ED-100G
Sonicador Q500 de Fisherbrand con sonda	Marca Pescadora	12893543
Idoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149
Tinción de proteína InstantBlue Coomassie	Expedeon	ISB1L
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Nonidet P-40	Fluka	56741
Peroxidasa AffiniCabra Pura AntiRatón IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Teléfono 115-035-003
Conjugado faloidina-tetrametilrodamina	Santa Cruz	SC-362065
Inhibidor de la proteasa	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
cloruro de sodio	Scharlau	SO0227
Dodecil sulfato de sodio	Sigma-Aldrich	L3771
Fluoruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Pirofosfato de sodio	Sigma-Aldrich	S6422-100G
Concentrador de vacío SpeedVac	ThermoFisher
Célula de transferencia semiseca Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940