Implantación de una ventana de imagen craneal en un modelo de ratón: un procedimiento quirúrgico para implantar cubreobjetos a base de vidrio para un acceso óptico estable a regiones del cerebro murino

Resumen

Fuente: Alieva, M. et al. Imágenes intravitales longitudinales del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva.J. Vis. Exp.(2019)

Este video presenta un procedimiento quirúrgico para implantar una ventana craneal en un modelo de ratón para un acceso óptico estable a diferentes regiones del cerebro.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Implantación de células tumorales y preparación de la ventana de imágenes craneales

1. Preparación quirúrgica
   1. Use ratones adultos (>6 semanas de edad) de cualquier cepa o género. Sedar a un ratón inyectando fluanisona [neuroléptico] + fentanilo [opioide]) (0,4 mL/kg) + sedante benzodiazepina (2 mg/kg) a una dosis de 1:1:2 en agua estéril. Evaluar el estado de sedación del animal mediante un pellizco en los dedos de los pies.
      nota: En este protocolo, se utilizaron ratones C57BL/6 hembra y macho debido a los mismos antecedentes genéticos de la línea celular tumoral utilizada en estos experimentos (GL261). El ratón permanecerá completamente sedado durante 1,5 h. Alternativamente, use anestesia inhalatoria como isoflurano (mezcla de isoflurano/O₂ al 1,5%-2%).
   2. Monte el mouse en un marco estereotáctico y asegure la cabeza con una pinza nasal y dos barras para los oídos.
   3. Utilice una lámpara de calefacción para mantener la temperatura corporal. La lámpara de calefacción debe usarse con precaución, alternativamente se pueden usar almohadillas térmicas de recirculación de agua.
   4. Aplica ungüento para los ojos para proteger las córneas del ratón de la sequedad.
   5. Utilice unas tijeras afiladas para afeitar el pelaje del cráneo (zona dorsal desde los ojos del ratón hasta la base del cráneo) y desinfecte la piel expuesta con etanol al 70%.
   6. Corta la piel de forma circular con unas tijeras afiladas y raspa el periostio que se encuentra por debajo con un bastoncillo de algodón. Aplicar una gota de lidocaína 1% + epinefrina 1:100.000 durante 5 min y retirar el exceso con un bastoncillo de algodón.
   7. Pega los bordes de la piel al cráneo con pegamento de cianoacrilato.
   8. Coloque el marco estereotáctico bajo un microscopio estereoscópico de disección con un aumento de 4x.
   9. Visualizar el cráneo a través del microscopio de disección y perforar un surco circular de 5 mm de diámetro sobre el hueso parietal derecho. Realice este paso con cuidado y solo superficialmente, evitando cualquier presión sobre el cráneo.
   10. Aplique una gota de tampón de corteza (125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glucosa, 10 mM de tampón HEPES, 2 mM de MgSO₄ y 2 mM de CaCl₂ [pH 7,4]) y levante el colgajo óseo con pinzas finas.
   11. Para los siguientes pasos, mantenga la superficie del cerebro cubierta con un tampón de la corteza a menos que se indique lo contrario.
   12. Bajo el microscopio de disección, visualice la superficie del cerebro y extraiga la duramadre con pinzas curvas, cónicas y de punta muy fina. Si se produce sangrado en esta etapa, use una esponja de gelatina absorbible para detenerlo.

>2. Preparación de la ventana de imágenes craneales

1. Retire el tampón de la corteza y coloque una gota de aceite de silicona en el sitio de la craneotomía para evitar burbujas de aire debajo de la ventana.
2. Selle el cerebro expuesto con un cubreobjetos de 6 mm. Aplica pegamento de cianoacrilato entre el cubreobjetos y la calavera. Presione suavemente el cubreobjetos contra el cráneo con la ayuda de pinzas finas para asegurar una distancia mínima entre el cerebro y el cubreobjetos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agujas hipodérmicas de 25G x 16 mm	BD Microlance
Esponja de gelatina reabsorbible	Pfizer	300600
Cubreobjetos redondos 6 mm	VWR internacional		Espuma de gel
Pegamento de cianoacrilato	Pattex	631-0168	Pattex Ultra gel
Cemento dental	Vértice Dental		Vértice autopolimerizable
perforar	Dremel		Dremel 3000 (el taladro dental puede ser más conveniente) + 105 Cortador de grabado
Pinzas curvadas finas	Dumont
Aceite de silicona	Sigma Aldrich	AGT508
Marco estereotáxico	Guardando	181838
Microscopio estereoscópico quirúrgico	Olimpo		Estereotáxico estándar de laboratorio, rata y ratón
Pomada oftálmica	Kela Veterinaria		Duodrops veter kela 10 m
Xilocaína (lidocaína 1% + epinefrina 1:100.000) Anestésico local	Astrazeneca		Xilocaína (lidocaína 1% + epinefrina 1:100.000)
Hipnorm	VetaPharma Ltd		Hypnorm (Citrato de fentanilo 0,315 mg/mL + Fluanisona 10 mg/mL)
Midazolam	Actavis		Midazolam Actavis 5 mg/mL