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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Imágenes intravitales
NOTA: El intervalo de tiempo entre la inyección de células tumorales y la primera sesión de imágenes intravitales depende del tipo de línea celular tumoral utilizada. Para los experimentos mostrados en este protocolo, se inyectaron 1x 105 células GL261 y se tomaron imágenes 10 días después.
- Preparación de imágenes
- Sedar al ratón con anestesia inhalatoria de isoflurano a través de una mascarilla (mezcla de isoflurano/O2 al 1,5%-2%).
- Inyecte al ratón por vía subcutánea 100 μL de tampón salino para prevenir la deshidratación.
nota: Para obtener imágenes a largo plazo, el ratón se puede hidratar a través de una bomba de infusión subcutánea.
- Coloque el ratón boca arriba en un cuadro de imagen. Utilice una placa de metal con un orificio de 1 mm de diámetro y pequeños imanes incrustados alrededor de la abertura para proporcionar la fijación del CIW a la caja de imágenes. Introduzca el isoflurano a través de una mascarilla y ventile por una salida en el otro lado de la caja (mezcla de isoflurano/O2 al 0,8%-1,5%). Opcionalmente, use cinta adhesiva para fijar el cuerpo del mouse.
nota: En este punto, se puede inyectar por vía intravenosa dextrano marcado con fluorescencia para la visualización de los vasos sanguíneos u otros tintes.
- Opcionalmente, use un oxímetro de pulso y una sonda de calentamiento para monitorear los signos vitales del mous.
nota: En este experimento, no fue necesario utilizar un oxímetro de pulso y una sonda de calentamiento, ya que el ratón se mantuvo estable durante todo el período de tiempo de obtención de imágenes (2-3 h). Sin embargo, para tiempos de imagen más prolongados, es posible que se necesite un control más exhaustivo.
- Ajuste el objetivo de agua 25x (por ejemplo, HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) a la posición z más baja y agregue una gota grande de agua.
nota: Se recomienda encarecidamente el uso de un microdispensador de inmersión en agua para experimentos a largo plazo, ya que permite a los científicos agregar agua durante el experimento. Alternativamente, se puede utilizar un objetivo seco.
- Transfiera la caja de imágenes al microscopio equipado con una cámara de clima oscuro que se mantiene a 37 °C. Lleve el objetivo al cubreobjetos CIW hasta que la gota de agua lo toque.
- Con el modo de epifluorescencia, observe el tumor a través del ocular y enfoque las células.
2. Adquisición de imágenes time-lapse
- Seleccione varias posiciones de interés para obtener una imagen y registre sus coordenadas en el software. Asegúrese de que las posiciones seleccionadas sean posiciones representativas de diferentes sitios del tumor (cada tumor puede ser diferente, pero para garantizar la consistencia, seleccione la misma cantidad de posiciones que son centrales para el núcleo del tumor y para los bordes en todos los ratones).
nota: Se puede realizar una gammagrafía de una parte del tumor o de todo el tumor visible; Sin embargo, si el tumor es grande, este método aumentará el lapso de tiempo entre las imágenes. Además, si las células tumorales se mueven rápidamente, puede ser difícil rastrear las mismas células a lo largo del tiempo.
- Cambie al modo multifotón y ajuste el láser a la longitud de onda correcta. Tenga en cuenta que para evitar el fotodaño, se desean longitudes de onda más altas.
nota: Para la obtención de imágenes Dendra2, se utilizó una longitud de onda de 960 nm. Con el objetivo utilizado en estos experimentos, un zoom de 1,3 fue suficiente para obtener una buena resolución de los núcleos tumorales y escanear un área representativa del tumor.
- Vaya al modo en vivo y defina una pila z para cada posición con el fin de adquirir el volumen máximo de células tumorales sin comprometer la resolución de las células tumorales. Defina el tamaño del paso entre las imágenes como 3 μm.
- Utilice el modo bidireccional para aumentar la velocidad de escaneo. La resolución de la imagen debe ser de al menos 512 x 512 píxeles.
- Adquiera imágenes del volumen del tumor en diferentes posiciones cada 20 min durante 2 h. Agregue agua al objetivo antes de cada adquisición de imagen.
nota: Las imágenes de lapso de tiempo se pueden adquirir automáticamente configurando el lapso de tiempo correcto en el software. Sin embargo, el mouse puede moverse y la posición o la pila z pueden cambiar con el tiempo, lo que provoca la pérdida de datos. Por lo tanto, se recomienda realizar el lapso de tiempo manualmente y verificar y ajustar los cambios xyz entre adquisiciones.
- En este paso, opcionalmente, fotointerruptor el marcador fluorescente Dendra2.
nota: A diferencia de las imágenes de lapso de tiempo (que permiten estudiar las propiedades individuales de las células tumorales y cómo cambian con el tiempo), esto permitirá estudiar el área de infiltración de células tumorales en el cerebro durante varios días.