>1. Ensayo de atracción de macrófagos in vitro
- Preparación de medios acondicionados
- Calentar el medio de mantenimiento de las células tumorales a un baño de agua a 37 °C durante 20 min.
- Rocíe la superficie de la campana de cultivo de tejidos con etanol al 70% y limpie la superficie con etanol al 70% con toallas de papel. Saca la solución de desprendimiento de células de la nevera. Rocíe las botellas del medio y la solución de desprendimiento de células con etanol al 70%, limpie el etanol al 70% en la superficie con toallas de papel y llévelas a la campana de cultivo de tejidos.
- Saque las placas de 6 pocillos de la incubadora. Pipetee cuidadosamente los medios acondicionados en tubos de centrífuga estériles de 15 ml. Coloque los tubos en hielo. Pipetee los medios en el pozo "Solo medios" en un tubo de centrífuga estéril de 15 mL separado.
NOTA: Antes de este paso, asegúrese de revisar bajo el microscopio para ver si las células se unen. De lo contrario, se pueden usar placas recubiertas para permitir una mejor fijación o incluir las celdas flotantes en el paso de conteo.
- Agregue 0,5 mL de solución de desprendimiento de celda en cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Comprueba si las células tumorales se agrupan cada minuto. Una vez que las células tumorales se redondeen, golpee suavemente el costado de la placa para ayudar a que las células se desprendan.
- Pipetear 2,5 mL de medio de mantenimiento de células tumorales en el pocillo, pipetear hacia arriba y hacia abajo 3 veces para mezclar y transferir las células a un tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Tome 10 μL de las células y mezcle con 10 μL de solución de Azul de Tripano. Pipetee 10 μL de la mezcla en el portaobjetos de recuento y cuantifique el número de células vivas mediante un contador automático de células.
- Ajuste el volumen del medio acondicionado de acuerdo con el número de células utilizando el medio de células madre libres de suero (incubación a 37 °C durante la noche). Por ejemplo, si el pocillo A tiene 3 veces más células vivas que el pocillo con el menor número de células, diluya su medio condicionado 1:3. Este paso se utiliza para controlar la diferencia causada por la tasa de proliferación celular.
nota: La razón para utilizar un medio de células madre libres de suero con incubación a 37 °C durante la noche es controlar el posible cambio en el medio con una exposición prolongada a 37 °C.
- Filtre los medios acondicionados a través de filtros de 0,45 μm. Coloque los medios acondicionados en hielo.
NOTA: Este paso elimina las células y los residuos de células en el medio acondicionado.
>2. Preparación de las células MV-4-11
- Calentar el medio IMDM (sin FBS) a un baño de agua a 37 °C durante 20 min.
- Rocíe la superficie de la campana de cultivo de tejidos con etanol al 70% y limpie la superficie con etanol al 70% con toallas de papel. Rocíe la botella mediana con etanol al 70%, limpie la superficie con etanol al 70% con toallas de papel y llévelas a la campana de cultivo de tejidos.
- Lleve el matraz de células MV-4-11 a la campana de cultivo de tejidos. Pipetear 10 mL de células en un tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Tome 10 μL de células y mezcle con 10 μL de solución de Azul de Tripano. Pipetee 10 μL de la mezcla en el portaobjetos de recuento y cuantifique el número de células vivas mediante un contador automático de células. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante.
- Lavar las células con 10 mL de PBS y centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células en medio IMDM (sin FBS) para obtener una densidad celular final de 1x106 células/mL.
NOTA: El número de celdas de macrófagos utilizado aquí se puede ajustar.
>3. Ensayo Transwell
NOTA: Para este paso, utilice un kit de ensayo de migración celular o compre los reactivos e insértelos por separado. Para las células MV-4-11, elija insertos Transwell con un tamaño de poro de 5 μm. Para detectar la migración de macrófagos, cuantifique directamente el número de macrófagos en la cámara inferior o utilice métodos colorimétricos/fluorimétricos. Aquí, demostramos el ensayo utilizando el método colorimétrico.
- Lleve la placa de 24 pocillos, el inserto y los reactivos a temperatura ambiente.
- Agregue 250 μL de celdas MV-4-11 preparadas anteriormente en cada inserto.
- Agregue 400 μL de medio/medio acondicionado solo (con incubación nocturna a 37 °C, estas muestras sirven como control negativo) a las cámaras inferiores de la placa de 24 pocillos. Para cada línea tumoral o control, use muestras por triplicado. Evite las burbujas entre el inserto y el medio acondicionado. Las burbujas inhibirán la migración de los macrófagos a los pozos del fondo.
- Incubar las placas en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 4 h.
NOTA: El tiempo de incubación se puede ajustar. Las células que migran a las cámaras inferiores se pueden ver bajo el microscopio.
- Golpee suavemente el inserto en la pared interior del mismo pocillo y deseche el inserto. Dado que las células MV-4-11 crecen en suspensión, no es necesaria una solución de desprendimiento celular ni un tratamiento con tripsina.
- Pipetea suavemente las células de los pocillos hacia arriba y hacia abajo 3 veces para mezclar. Transfiera 225 μL de suspensión celular a una placa de 96 pocillos de pared negra adecuada para la medición fluorescente.
- Diluya el colorante CyQuant 1:75 con tampón de lisis 4x. Agite brevemente el vórtice y baje la solución. Agregue 75 μL de solución a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
- Lea la fluorescencia utilizando el juego de filtros de 480/520 nm con un lector de placas de fluorescencia.
- Analice los datos restando el blanco y normalizando a la línea celular tumoral de control.
