Extracción de vesículas extracelulares: una técnica para aislar vesículas extracelulares de muestras de tejido completo mediante centrifugación diferencial

Resumen

Fuente: Hurwitz, S. N. et al. Extracción de Vesículas Extracelulares de Tejido Entero. J. Vis. Exp. (2019)

Este video describe la técnica de extracción de vesículas extracelulares de tejidos frescos o congelados. Las vesículas extracelulares aisladas se pueden utilizar para análisis posteriores y descubrir su papel significativo en la patogénesis de la enfermedad.

Protocolo

1. Disociación tisular y centrifugación diferencial

1. Prepare 10 mL de tampón de disociación (10 mg de papaína; 5,5 mM de L-cisteína; 67 μM de 2-mercaptoetanol; 1,1 mM de EDTA) en medio Hibernate-E para aproximadamente 0,4-1,0 g de tejido><. NOTA: Todas las soluciones utilizadas para el enriquecimiento y purificación de EV deben diluirse en agua filtrada ultrapura.
2. Añadir tejido entero, fresco o congelado al tampón de disociación en un tubo cónico de 50 mL e incubar en un baño de agua tibia a 37 °C durante 20 min. Si es necesario, el tejido puede cortarse en fragmentos más pequeños antes de la incubación.
3. Después de la incubación, agregue inhibidores de proteasa y fosfatasa para una concentración final de 1x al tampón de disociación que contiene el tejido.
4. Vierta la solución que contiene el tejido en un homogeneizador Dounce de ajuste holgado y disocie suavemente el tejido utilizando aproximadamente 30 movimientos lentos por muestra. El número de accidentes cerebrovasculares se puede ajustar en función de la consistencia del tejido.
5. Transfiera el tejido disociado en tampón a un tubo cónico de 50 mL y centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C para granular las células y los fragmentos de tejido fibroso o cohesivo restantes.
6. Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico limpio de 50 mL y centrifugue a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C para pellet y desechar los residuos celulares grandes.
7. Transfiera nuevamente el sobrenadante a un tubo cónico limpio de 50 mL y centrifugue a 10,000 x g durante 40 min a 4 °C para pellet vesículas más grandes no deseadas o cuerpos apoptóticos pequeños.
   NOTA: Este pellet se puede guardar para un estudio adicional de vesículas más grandes si se desea.
8. Decantar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 μm en un tubo de ultracentrifugación limpio de 12 mL.
   nota: Es posible que las muestras de tejido fibrótico densamente no se filtren fácilmente. Estas muestras se pueden filtrar a través de un filtro de células de 40 μm, luego pasar a través de agujas más pequeñas en serie (18 G, 20 G, 22 G) antes de filtrar a través del filtro de 0,45 μm.
9. Ultracentrífuga la muestra a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C para pellet pequeños EV.
10. Decantar el sobrenadante y dejar los tubos de ultracentrifugación invertidos durante 5-10 min, golpeando frecuentemente para eliminar el líquido residual en los lados de los tubos. El fluido residual también se puede aspirar con una pipeta de vacío de aspiración.
11. Vuelva a suspender el pellet EV en 1,5 mL de tampón de sacarosa 0,25 M (10 mM Tris, pH 7,4). Es importante asegurar la resuspensión completa del pellet en este paso. Para ello, cubra los tubos con parafilm antes de convertir los vehículos eléctricos en vórtice en solución. Agite los tubos de ultracentrífuga durante 15-20 minutos a temperatura ambiente antes de una mezcla final de vórtice.
12. Centrifugar brevemente los tubos a una velocidad no superior a 1.000 x g para recuperar la suspensión líquida en el fondo del tubo.
13. Continúe con los pasos de purificación de gradiente a continuación o, si es necesario, almacene la suspensión EV a 4 °C durante la noche.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de 0,45 μm	VWR	28145-505
Tubos ultracentrífugos de 12 mL	Beckman Coulter	331372
Tubos ultracentrífugos de 5,5 mL	Beckman Coulter	344057
Inhibidor de la fosfatasa HALT (solución 100x)	ThermoFisher Scientific	78420
Inhibidor de la proteasa HALT (solución 100x)	ThermoFisher Scientific	78438
Hibernar E medio	ThermoFisher Scientific	A1247601
Rotor de cuchara oscilante MLS-50	Beckman Coulter	367280
Ultracentrífuga de sobremesa Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315