Purificación de subpoblaciones de vesículas extracelulares: una técnica para purificar subpoblaciones de vesículas extracelulares mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad

Resumen

Fuente: Urwitz, S. N. et al. Extracción de vesículas extracelulares de tejido entero. J. Vis. Exp. (2019)

Este video demuestra el método de purificación basado en ultracentrifugación en gradiente de densidad para aislar subpoblaciones de vesículas extracelulares adecuadas para estudios de caracterización.

Protocolo

1. Purificación por gradiente de densidad

1. Añadir 1,5 mL de yodixanol al 60% (solución madre en agua) al tampón de 1,5 mL de sacarosa/Tris que contiene EVs para crear una solución final que contenga un 30% de iodixanol. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar bien la solución.
   nota: Tenga cuidado para evitar perder solución en la punta de la pipeta, ya que la alta concentración de yodixanol es bastante viscosa.
2. Transfiera la solución tampón de yodixanol al 30% que contiene EV al fondo de un tubo de ultracentrifugación de 5,5 mL.
3. Prepare al menos 1,5 ml de soluciones de yodixanol al 20% y al 10% por muestra en agua ultrapura a partir de la solución madre de yodixanol al 60%.
4. Mida 1,3 ml de yodixanol al 20% y aplique cuidadosamente la capa inferior de degradado con una jeringa y una aguja de 18 G. Para evitar mezclar las capas en la interfaz de densidad, mantenga el bisel de la aguja en contacto con el interior del tubo de ultracentrifugación justo por encima del menisco y agregue la solución gota a gota.
5. Coloque 1,2 mL de solución de yodixanol al 10% sobre la capa de iodixanol al 20% utilizando la misma técnica que la anterior.
6. Equilibre y cargue cuidadosamente los tubos de ultracentrifugación en los cubos del rotor y centrífugue en un rotor de cubo oscilante a 268.000 x g durante 50 minutos a 4 °C. Ajuste las velocidades de aceleración y desaceleración de la centrífuga a las tasas mínimas permitidas para evitar la interrupción de las capas de densidad.
7. Etiquete diez tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada muestra para que correspondan a las fracciones 1 a 10 de los gradientes de densidad. La fracción 1 se designa como la fracción superior que se eliminará primero, mientras que la fracción 10 es la fracción inferior que se eliminará por última vez.
8. Una vez que se haya completado la ultracentrifugación en gradiente, retire suavemente los tubos de los cubos del rotor y colóquelos en un soporte estable. A menudo se verá una banda visible de vesículas en la fracción de interés. Pipetear diez fracciones seriadas de 490 μL desde la parte superior del gradiente en los tubos correspondientes. Quedará una pequeña cantidad de líquido en el fondo del tubo que probablemente contenga proteínas contaminantes. Esta muestra se puede descartar o conservar como fracción 11, si se desea.
9. Mida los índices de refracción de las fracciones con un refractómetro. Esto también se puede realizar con un gradiente de control ejecutado en paralelo si es necesaria la conservación de la muestra. Pipetear 20-30 μL de cada fracción que contenga yodixanol en la superficie del refractómetro y estimar la densidad comparando los índices de refracción con las densidades conocidas de iodixanol.
   nota: Las fracciones se pueden almacenar durante la noche en la solución que contiene yodixanol si es necesario antes de pasar al siguiente paso de lavado por ultracentrifugación.
10. Transfiera cada fracción a un tubo de ultracentrifugación limpio de 12 mL. Añadir 5 mL de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS; 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄, 2 mM de KH₂PO₄, pH 7,4) al tubo y mezclar pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: El PBS añadido a las muestras debe estar libre de partículas, lo que se garantiza filtrando el PBS estéril a través de un filtro de 0,22 μm y almacenándolo a temperatura ambiente para evitar la precipitación de sal.
11. Agregue 6 ml adicionales de 1x PBS en la parte superior y nuevamente mezcle con cuidado.
12. Ultracentrífuga los tubos a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C para regranular pequeñas vesículas. Decantar el sobrenadante y secar los tubos antes de la lisis de las vesículas para el análisis de proteínas o la resuspensión de las EV para el análisis morfológico.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtro de 0,45 μm	VWR	28145-505
Tubos ultracentrífugos de 12 mL	Beckman Coulter	331372
Tubos ultracentrífugos de 5,5 mL	Beckman Coulter	344057
Rotor FA-45-6-30	Eppendorf	5820715006
Rotor de cuchara oscilante MLS-50	Beckman Coulter	367280
Ultracentrífuga de sobremesa Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315
Ultracentrífuga Optima XE-100	Beckman Coulter	A94516
Optiprep	sigma	D1556	Yodixanol al 60% en solución de agua estéril
Refracto 30PX (refractómetro)	Mettler Toledo	51324650
Rotor S-4-104	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti rotor de cuchara oscilante	Beckman Coulter	333790
Centrífuga de sobremesa 5804R	Eppendorf	22623508