Generación de Células Madre Neurales Inducidas (iNSCs) a partir de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMNCs): Un Procedimiento Basado en el Virus de Sendai para Reprogramar PBMNCs en iNSCs

Resumen

Fuente: Zheng, W. et al. Generación de células madre neurales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante.J. Vis. Exp. (2019)

Este video muestra la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) en células madre neurales inducidas (iNSCs) utilizando el virus de Sendai. El virus Sendai es un virus no integrador que ofrece un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación de células.

Protocolo

>1. Reprogramación de PBMNCs a iNSCs por Infección SeV

1. Preparación de la solución y del medio de cultivo
   1. Prepare una solución madre de poli-D-lisina (PDL) disolviendo 100 mg de PDL con 100 mL de_H2O a una concentración de 1 mg/mL. Almacenar a -20 °C en alícuotas de 1 mL.
   2. Prepare una solución madre de insulina disolviendo 100 mg de insulina en 20 mL de HCl 0,01 N a una concentración de 5 mg/mL. Almacenar a -20 °C en alícuotas de 1 mL.
   3. Para preparar 200 mL de medio basal iNSC, combine 96 mL de DMEM-F12 y 96 mL de medio básico (Tabla de Materiales) con 2 mL de solución madre de glutamina 100x, 2 mL de aminoácidos no esenciales (NEAA), 2 mL de suplemento de N2 y 2 mL de suplemento de B27. Agregue 10 ng/ml de factor inhibidor de la leucemia humana recombinante, 3 μM CHIR99021 y 2 μM SB431542 antes de usar. Filtre el medio y guárdelo a 4 °C.
      nota: Utilice el medio dentro de las 2 semanas. Agregue el factor inhibidor recombinante de la leucemia humana, CHIR99021 y SB431542 inmediatamente antes de usar.
2. Reprogramación de PBMNCs a iNSCs por infección por SeV
   1. Esterilizar con rayos ultravioleta un banco limpio antes de usarlo. Esterilizar todas las superficies y equipos con alcohol al 75%. Esterilizar todas las puntas con un autoclave.
   2. El día 0, recoja las células en medio MNC y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 1 mL de medio MNC precalentado.
   3. Cuente las células viables con azul de tripán. Vuelva a suspender las celdas con medio MNC precalentado (37 °C) a una concentración de 2 x 10⁵ celdas por pocillo en placas de 24 pocillos.
   4. Después de retirar los tubos de SeV del almacenamiento a -80 °C, descongele los tubos que contienen SeV en un baño de agua a 37 °C durante 5-10 s y, a continuación, deje que se descongelen a RT. Una vez descongelados, colóquelos en hielo inmediatamente.
   5. Agregue el SeV que codifica Klf4 humano, Oct3/4, SOX2 y c-MyC a los pocillos, con una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Centrifugar las células con placas a 1.000 x g durante 30 min para facilitar la fijación de las células. Deje las células y el sobrenadante en las placas. Coloque las placas en la incubadora a 37 °C, 5% CO₂.
      PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos que involucren SeV deben realizarse en un gabinete de seguridad, y todas las puntas y tubos deben tratarse con etanol o lejía antes de desecharlos.
   6. El día 1, transfiera el medio y las células a un tubo de centrífuga de 15 ml. Enjuague el pocillo con 1 mL de medio MNC. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 500 μL de medio MNC fresco precalentado en placas de 24 pocillos.
      nota: Utilice una placa de 24 pocillos de fijación baja para evitar la fijación de cualquier celda antes de colocar la placa en PDL/laminina.
   7. El día 2, diluya 1 mL de 1 mg/mL de PDL con 19 mL de D-PBS a una concentración de 50 μg/mL. Cubra las placas de 6 pocillos con 50 μg/mL de PDL durante al menos 2 h a RT.
   8. Diluir 200 μL de laminina de 0,5 mg/mL con 20 mL de D-PBS hasta una concentración de 5 μg/mL. Aspire PDL en las placas de 6 pocillos y seque en el banco limpio vertical.
   9. Cubra las placas de 6 pocillos con laminina de 5 μg/mL e incube durante 4-6 h a 37 °C. Lavar con D-PBS antes de usar.
   10. En el día 3, coloque las células transducidas obtenidas en el paso 1.2.6 en medio iNSC en placas de 6 pocillos recubiertas de PDL/laminina.
       nota: Mueva las placas suavemente si es necesario después de que las células se coloquen en placas recubiertas de PDL/laminina, tratando de no perturbar la unión de las células.
   11. El día 5, agregue 1 mL de medio iNSC precalentado (37 °C) en cada pocillo en placas de 6 pocillos suavemente.
       nota: Se espera que las células sufran una muerte drástica (>60%).
   12. El día 7, agregue 1 mL de medio iNSC precalentado (37 °C) en cada pocillo en placas de 6 pocillos suavemente.
   13. Desde el día 9 hasta el día 28, sustituya el medio gastado por un medio iNSC nuevo y precalentado (37 °C) todos los días. Monitorear la aparición de colonias de iNSC. Recoge y transfiere clones de iNSC para expandirlos en unas 2-3 semanas. Recoger las colonias con la morfología adecuada utilizando pipetas de vidrio quemado, excluyendo cualquier célula posiblemente contaminante, y aspirar las colonias con puntas de 200 μL.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suplemento de B27	Invitrogen	17504044
CHIR99021	Operación de genes	04-0004
DMEM-F12	Gibco	11330
DMEM-F12	Gibco	11320
Laminina	Roche	11243217001
Suplemento de N2	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	Aminoácido no esencial
Neurobasal	Gibco	10888	Medio básico
Pdl	Sigma-Aldrich	P7280	Poli-D-lisina
SB431542	Operación de genes	04-0010-10mg	Almacenar a partir de la luz a -20?
Virus de Sendai	Tecnologías de la Vida	MAN0009378
insulina	Roche	12585014
Placa de 24 pocillos	Corning	3337
Tubo cónico de 15 ml	Corning	430052
Placa de 6 pocillos	Corning	3516
EPO	Peprotech	100-64-50UG	Eritropoyetina humana
Factor inhibidor de la leucemia humana	Millpore	LIF1010
SCF recombinante humano	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	Factor de crecimiento similar a la insulina humana
IL-3	Peprotech	200-03-10UG	Interleucina humana 3
dexametasona	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
IMDM	Gibco	215056-023	El medio de Iscove modificado por Dulbecco
insulina	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	51500-056	Suplemento de insulina-transferrina-selenio-X
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 × solución madre de glutamina
Jamón-F12	Gibco	11765-054
1-Tioglicerol	Sigma-Aldrich	M6145	Tóxico para inhalación y contacto con la piel
ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A92902	Tóxico con el contacto con la piel
Reemplazo de suero knockout	Gibco	10828028	Medio basal libre sérico
Concentrado lipídico químicamente definido	Invitrogen	11905031
Transferrina	Sistemas de investigación y desarrollo	2914-HT-100G
Azul de tripano	Gibco	T10282