Aislamiento de ADN libre de células circulantes (cfDNA): Un procedimiento de membrana a base de sílice para extraer cfDNA del plasma sanguíneo de pacientes con cáncer

Resumen

Fuente: Palande, V. et al. Detección de ADN libre de células en muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer. J. Vis. Exp. (2020)

Este video describe un procedimiento de membrana a base de sílice para aislar ADN libre circulante de células o cfDNA de una muestra de plasma humano. El ADNcf es un biomarcador prometedor para el diagnóstico y la evaluación del cáncer.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de conformidad con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Purificación de ADNcf circulante a partir de 1 mL de plasma

NOTA: Este paso se realiza con un kit comercial (ver Tabla de Materiales). Todos los tampones se proporcionan con el kit.

1. Preparación de tampones y reactivos
   cautela: No agregue soluciones ácidas o lejía directamente a los desechos de preparación de muestras. Las sales de guanidina presentes en el tampón de lisis, el tampón de unión y el tampón de lavado-1 cuando se combinan con lejía o ácidos pueden producir compuestos altamente reactivos.
   1. Tampón aglutinante: Mezcle 300 mL de concentrado tampón aglutinante con 200 mL de isopropanol al 100% para hacer 500 mL de tampón aglutinante de trabajo. Almacenar a temperatura ambiente.
      nota: El tampón de unión permite la unión óptima de los ácidos nucleicos circulantes a la membrana de sílice. 500 mL del tampón de unión son suficientes para procesar 276, 138, 92, 69 o 55 muestras de 1, 2, 3, 4 o 5 mL de plasma, respectivamente, y son estables durante 1 año a temperatura ambiente.
   2. Tampón de lavado-1: Mezcle 19 mL de concentrado de tampón de lavado-1 con 25 mL de etanol al 96-100% para hacer 44 mL de tampón de lavado-1 en funcionamiento. Almacenar a temperatura ambiente.
      nota: Wash Buffer-1 elimina los contaminantes unidos a la membrana de sílice. 44 mL de tampón de lavado-1 de trabajo son suficientes para procesar 73 muestras de 1/2/3/4/5 mL de plasma y son estables durante 1 año a temperatura ambiente.
   3. Tampón de lavado-2: Mezcle bien 13 mL de concentrado de tampón de lavado-2 con 30 mL de etanol al 96-100% para producir 43 mL de tampón de lavado-2 en funcionamiento. Almacenar a temperatura ambiente.
      nota: Wash Buffer-2 elimina los contaminantes unidos a la membrana de sílice. 43 mL de tampón de lavado-2 en funcionamiento son suficientes para procesar ~56 muestras de 1/2/3/4/5 mL de plasma y son estables durante 1 año a temperatura ambiente.
   4. A un tubo que contenga 310 μg de ARN portador liofilizado, agregue 1.550 μL de tampón de elución, para preparar una solución de ARN portador de 0,2 μg/μL. Después de disolver completamente el ARN portador, divida la solución en alícuotas adecuadas y almacene entre -30 °C y -15 °C. No congele y descongele estas alícuotas más de 3 veces. Al tampón de lisis, como se muestra en la Tabla 1, agregue el ARN portador reconstituido disuelto en el tampón de elución.
      nota: Debido a que el ARN portador no se disuelve directamente en el tampón de lisis, primero debe disolverse en un tampón de elución y luego en un tampón de lisis. En primer lugar, la unión de la membrana de sílice a los ácidos nucleicos mejora cuando hay muy pocas moléculas objetivo presentes en la muestra. En segundo lugar, el riesgo de degradación del ARN se reduce debido a la presencia de grandes cantidades de ARN portador.
2. Antes de comenzar el aislamiento, lleve las columnas y las muestras a temperatura ambiente y ajuste los volúmenes de muestra a 1 ml con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), si es necesario. Precaliente 2 baños de agua o bloques calefactores que contengan tubos de centrífuga de 50 ml y tubos de recolección de 2 ml a 60 °C y 56 °C, respectivamente.
3. A un tubo de centrífuga de 50 mL, agregue 100 μL de proteinasa K, 1 mL de plasma y 0,8 mL de tampón de lisis que contenga 1,0 μg de ARN portador (preparado en el paso 1.1.4). Cierre el tubo de centrífuga con una tapa y mezcle el contenido mediante vórtice de pulso durante 30 s, asegurándose de un vórtice visible en el tubo. La mezcla completa del contenido es importante para una lisis eficiente.
   nota: Inmediatamente después del vórtice, continúe con el paso 1.4, sin demora.
4. Incubar la solución a 60 °C durante 30 min.
5. Retire el tapón, añada 1,8 ml del tampón aglutinante al tubo y mezcle bien con el vórtice de pulsos durante 15-30 s después de colocar el tapón.
6. Incubar la mezcla resultante durante 5 minutos en hielo e insertar la columna de membrana de sílice en el aparato de vacío que está conectado a la bomba de vacío. A continuación, inserte firmemente un extensor de tubo de 20 ml en la columna abierta para evitar fugas de muestra.
7. Vierta con cuidado la mezcla incubada en el extensor de tubos de la columna y encienda la bomba de vacío. Después de que toda la mezcla de lisado pase completamente a través de las columnas, apague la bomba de vacío, libere la presión a 0 mbar y retire y deseche el extensor de tubo.
   nota: Para evitar la contaminación cruzada, el extensor de tubo debe desecharse con cuidado para evitar que se extienda por las columnas adyacentes.
8. Retire la columna del aparato de vacío, insértela en el tubo de recolección y centrifugue a 11.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente, para eliminar cualquier lisado residual. Deseche el flujo continuo.
9. Añadir 600 μL de tampón de lavado-1 en la columna, centrifugar a 11.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente, desechar el flujo.
10. Añada 750 μL de tampón de lavado-2 a la columna, centrifugue a 11.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y deseche el flujo.
11. Agregue 750 μL de etanol (96-100%) a la columna, centrifugue a 11.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente y deseche el flujo.
12. Centrifugar la columna a 20.000 x g durante 3 min, colocándola en un tubo de recolección limpio de 2 mL.
13. Seque completamente el conjunto de la columna de membrana colocándolo en un nuevo tubo de recolección de 2 ml con la tapa abierta e incubando a 56 °C durante 10 minutos.
14. Coloque la columna en un tubo de elución limpio de 1,5 mL. En el centro de la membrana de la columna, aplique 20-150 μL de tampón de elución e incube a temperatura ambiente durante 3 min con la tapa cerrada.
    nota: Asegúrese de que el tampón de elución esté equilibrado a temperatura ambiente. En caso de utilizar un tampón de elución inferior a 50 μL, asegúrese de que se dispense con cuidado en el centro de la membrana. Esto ayuda a la elución completa del ADN unido. Sin embargo, el volumen de elución no es fijo y se puede cambiar según las aplicaciones posteriores. El eluido recuperado puede ser de hasta 5 μL y ciertamente menor que el volumen de elución aplicado a la columna.
15. Centrifugar el eluido recuperado en una microcentrífuga a 20.000 x g durante 1 min para eluir los ácidos nucleicos y almacenar a -20 °C.

Número de muestra	Tampón de lisis (mL)	ARN portador en tampón de elución (μL)
1	0.9	5.6
número arábigo	1.8	Artículo 11.3
3	2.6	Artículo 16.9
4	3.5	22.5
5	4.4	Artículo 28.1
6	5.3	Artículo 33.8
7	6.2	Artículo 39.4
8	7	45
9	7.9	Artículo 50.6
10	8.8	Artículo 56.3
11	9.7	61.9
12	10.6	67.5
13	Artículo 11.4	Artículo 73.1
14	Artículo 12.3	78.8
15	Artículo 13.2	Artículo 84.4
16	Artículo 14.1	90
17	15	Artículo 95.6
18	Artículo 15.8	Artículo 101.3
19	Artículo 16.7	Artículo 106.9
20	Artículo 17.6	Artículo 112.5
21	18.5	Artículo 118.1
22	Artículo 19.4	Artículo 123.8
23	Artículo 20.2	Artículo 129.4
24	Artículo 21.1	135

Tabla 1. Volúmenes de tampón de lisis y ARN portador (disuelto en tampón de elución) necesarios para procesar muestras de plasma de 1 mL.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ADN de alta sensibilidad Agilent	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	Los ensayos de ADN de alta sensibilidad se utilizan a menudo para el control de calidad de muestras para bibliotecas de secuenciación de próxima generación.
Tubos conservantes cf-DNA/cf-RNA	Norgen Biotek Corp.	63950	Los tubos conservantes cf-DNA/cf-RNA de Norgen son tubos de plástico cerrados y evacuados para la recolección y conservación de cfDNA, ADN tumoral circulante, cf-RNA y células tumorales circulantes en muestras de sangre humana completa durante el almacenamiento y el envío
Kit de ácido nucleico circulante QIAamp	Qiagen	55114	El kit de ácidos nucleicos circulantes QIAamp permite la purificación eficiente de estos ácidos nucleicos circulantes a partir de plasma o suero humano y otros fluidos corporales libres de células.
Colector de vacío QIAvac 24 Plus	Qiagen	Año 19413	El colector de vacío QIAvac 24 Plus está diseñado para el procesamiento por vacío de columnas QIAGEN en paralelo.
Sistema de conexión QIAvac	Qiagen	Año 19419	En combinación con el sistema de conexión QIAvac, el colector de vacío QIAvac 24 Plus se puede utilizar como sistema de flujo. El flujo de la muestra, que contiene material posiblemente infeccioso, se recoge en una botella de residuos separada.
Sistema de conexión QIAvac	Qiagen	Año 19419	En combinación con el sistema de conexión QIAvac, el colector de vacío QIAvac 24 Plus se puede utilizar como sistema de flujo. El flujo de la muestra, que contiene material posiblemente infeccioso, se recoge en una botella de residuos separada.
misceláneo
Tubos de centrífuga de 50 mL
Hielo picado
Etanol (96-100%)
Bloque calefactor o similar a 56 °C (capaz de contener tubos de recogida de 2 mL)
Isopropanol (100%)
Microcentrífuga
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
Pipetas (ajustables)
Puntas de pipeta estériles (se recomiendan puntas de pipeta con barreras contra aerosoles para ayudar a prevenir la contaminación cruzada)
Baño de agua o bloque calefactor capaz de contener tubos de centrífuga de 50 mL a 60 °C