Análisis automatizado de distribución del tamaño de los fragmentos basado en electroforesis capilar del ADNcf: un método basado en microchips de ADN para estudiar la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN aislados de biofluidos

Resumen

Fuente: Palande, V. et al. Detección de ADN libre de células en muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer. J. Vis. Exp. (2020)

En este vídeo, analizamos la distribución del tamaño de los fragmentos de ADN libre de células o cfDNA mediante electroforesis capilar automatizada. Esta técnica ayuda a obtener información sobre el perfil de los fragmentos de ADN liberados por las células cancerosas durante la apoptosis.

Protocolo

>1. Tamaño del fragmento de ADN Distribución de cfDNA por Fragment Analyzer

1. El paso antes de iniciar el procedimiento: Equilibre el concentrado de tinte de ADN y la matriz de gel de ADN a temperatura ambiente durante 30 minutos.
2. Preparación de la mezcla de gel-tinte
   nota: Manipule las soluciones con precaución, ya que se sabe que el DMSO facilita la entrada de moléculas orgánicas en los tejidos.
   1. Descongele completamente el DMSO mediante el vórtice del vial de concentrado de colorante de ADN durante 10 s. Pipetee 15 μL de este concentrado en un vial de matriz de gel de ADN y guárdelo a 4 °C en la oscuridad.
   2. De nuevo, agite el vial tapado durante 10 s hasta que se visualice la mezcla del gel y el colorante.
   3. Vierta la mezcla en un filtro giratorio hasta el receptáculo superior.
   4. Microcentrifugar el filtro de centrifugado a 2.240 x g ± 20% durante 10 min a temperatura ambiente.
   5. Etiquete el tinte en gel preparado en el tubo y deseche el filtro, según las buenas prácticas de laboratorio. Etiquete el tubo y anote la fecha de preparación.
      nota: Deseche el filtrado según las buenas prácticas de laboratorio. La mezcla de gel y tinte se puede utilizar para 5 chips de ADN de alta sensibilidad (HS). Si no se utiliza durante más de 1 hora, almacene a 4 °C. Es posible almacenarlo en la oscuridad hasta por 6 semanas.
3. Para cargar la mezcla de gel y tinte, asegúrese de la posición de la placa base de la estación de cebado de virutas y ajuste el clip en la posición más baja.
   1. Equilibre la mezcla de gel y tinte a temperatura ambiente durante 30 minutos, mientras controla la exposición a la luz.
   2. Tome un nuevo chip de ADN HS de una bolsa sellada y colóquelo en la estación de cebado de chips, luego retire 9.0 μL de la mezcla de gel y colorante y dispense en el fondo del pozo de chips, marcado como 'G'.
      nota: Aspire la mezcla de gel y colorante, evitando las partículas que puedan acumularse en el fondo del vial. Mientras dispensa la mezcla de gel y colorante en el pozo del chip de ADN HS, inserte la punta de la pipeta completamente para evitar la formación de grandes burbujas de aire. Además, tocar la pipeta en los bordes del pocillo producirá malos resultados.
   3. Coloque el émbolo a 1 mL y cierre la estación de cebado de virutas. Asegúrese de que el bloqueo del pestillo haga clic y ajuste el temporizador a 60 s, luego presione el émbolo hacia abajo hasta que el clip lo sostenga y, exactamente después de 60 s, suelte el émbolo con el mecanismo de liberación del clip.
   4. Cuando el émbolo se retire al menos a la marca de 0,3 mL, espere 5 s y luego retroceda lentamente a la posición de 1 mL, luego abra la estación de cebado de virutas y nuevamente retire 9.0 μL de la mezcla de gel y colorante y dispense en la parte inferior del pocillo del chip de ADN HS, marcado como 'G'.
4. Para cargar el marcador de ADN, dispense 5 μL del marcador de ADN en el pocillo, marcado con el símbolo de la escalera. Repita el procedimiento para los 11 pocillos de muestra.
5. Para cargar la escalera y las muestras, dispense 1 μL de la escalera de ADN en el pocillo, marcado con el símbolo de la escalera, y luego agregue 1 μL de muestra (pocillos usados) o 1 μL de marcador (pocillos no utilizados) en los 11 pocillos de muestra.
6. Agite el chip HS DNA durante 60 s a 2.400 rpm colocando el chip horizontalmente en el adaptador. Asegúrese de que la protuberancia que fija el chip de ADN HS no se dañe durante el vórtice.
7. Para insertar el chip de ADN HS en el instrumento analizador de fragmentos, abra la tapa y asegúrese de que el cartucho de electrodos esté insertado correctamente, y que el selector de chips esté colocado en 'dsHigh Sensitivity DNA' en el instrumento analizador de fragmentos.
8. Monte con cuidado el chip de ADN HS en el receptáculo, que encaja de una sola manera, luego cierre la tapa asegurándose de que el cartucho de electrodos encaje exactamente en los pocillos del chip de ADN HS.
9. La pantalla del software del analizador de fragmentos indica el chip de ADN HS insertado y la tapa cerrada a través del icono del chip en la parte superior izquierda de la pantalla.
10. Para iniciar la ejecución del chip de ADN HS, seleccione el ensayo de alta sensibilidad dsDNA en el menú 'Ensayo' en la pantalla del instrumento, luego complete correctamente la tabla de nombres de muestras alimentando información como nombres de muestras y comentarios e inicie la ejecución del chip haciendo clic en el botón 'Inicio' en la parte superior derecha de la pantalla.
11. Limpieza de electrodos después de la ejecución de un chip de ADN HS: Retire inmediatamente el chip de ADN HS usado tan pronto como se complete el ensayo y deséchelo de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Realice el siguiente procedimiento para asegurarse de que los electrodos estén limpios, sin residuos sobrantes del ensayo anterior.
    1. Llene lentamente 350 μL de agua desionizada de grado de análisis en uno de los pocillos del limpiador de electrodos y coloque el limpiador de electrodos en el instrumento analizador de fragmentos abriendo la tapa y luego cierre la tapa y espere unos 10 s.
    2. Retire el limpiador de electrodos abriendo la tapa y espere otros 10 segundos para que el agua de los electrodos se evapore antes de cerrar la tapa.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2100 Instrumento bioanalizador	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	El sistema 2100 Bioanalyzer es una herramienta de electroforesis automatizada establecida para el control de calidad de muestras de biomoléculas.
Clip ajustable para la estación de cebado	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Se utiliza en combinación con la jeringa para aplicar una presión definida para el cebado de virutas.
Tubos conservantes cf-DNA/cf-RNA	Norgen Biotek Corp.	63950	Los tubos conservantes de cf-DNA/cf-RNA de Normen son tubos de plástico cerrados y evacuados para la recolección y conservación de cf-DNA, ADN tumoral circulante, cf-RNA y células tumorales circulantes en muestras de sangre entera humana durante el almacenamiento y el envío
Estación de cebado de virutas	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Se utiliza para cargar la matriz de gel en un chip con una jeringa provista con cada kit de ensayo, se utiliza para ensayos de ARN, ADN y proteínas. Incluye estación de cebado, cronómetro y 1 pinza para jeringa
Kit limpiador de electrodos	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Evita la contaminación cruzada. Elimina los contaminantes bacterianos o proteicos de los electrodos.
Filtros para Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	Llame la atención al 185-5990	Se utiliza para la mezcla adecuada de concentrado de colorante de ADN y matriz de gel de ADN
Vórtice de chip básico de IKA	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Se utiliza para la mezcla adecuada de la escalera de ADN y la muestra de ADN en los chips de ensayo del Bioanalyzer
Tubos de centrífuga de 50 ml
Etanol (96-100%)
Bloque calefactor o similar a 56 °C (capaz de contener tubos de recogida de 2 ml)
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
Pipetas (ajustables)
Puntas de pipeta estériles (se recomiendan puntas de pipeta con barreras contra aerosoles para ayudar a prevenir la contaminación cruzada)
Baño de agua o bloque calefactor capaz de contener tubos de centrífuga de 50 mL a 60 °C