Reacción en cadena de la polimerasa digital en gotasas: un método para generar reacciones de PCR con nanogotas para detectar mutaciones tumorales raras

Resumen

Fuente: Bonner, E. R. et al. Detección y Monitoreo de ADN Circulante Asociado a Tumores en Biofluidos de Pacientes. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, presentamos un procedimiento paso a paso para generar nano-gotas emulsionadas para detectar ácidos nucleicos objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa digital o dPCR.

Protocolo

>1. Detección y cuantificación de ADN objetivo mediante dPCR

1. Prepare la mezcla de reacción de dPCR para 8 pocillos del tubo de tira de PCR más un 10% extra, agregando 220 μL de mezcla maestra de genotipado, 8,8 μL de 10 μM de sondas de tipo salvaje y mutantes, 39,6 μL de 10 μM de cebadores directos e inversos y 17,6 μL de aceite estabilizador de gotas.
2. Mezcle suavemente la mezcla de reacción de dPCR pipeteando todo el volumen hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces. No agite en vórtice ni centrifuga después de que se haya agregado aceite estabilizador de gotas a la mezcla de reacción.
3. Obtenga un tubo de tira de PCR de 8 pocillos y dispense 38 μL de mezcla de reacción de dPCR directamente en el fondo de cada pocillo. Elimine las burbujas con una punta de pipeta limpia.
   NOTA: Los tubos de tiras de PCR que están entrelazados o apretados pueden dar lugar a cargas eléctricas estáticas, lo que provoca coalescencia y una señal ruidosa al analizar los datos de dPCR. Para evitar esto, pele los tubos en bolsas separadas para riesgos biológicos, evite empacar demasiado las bolsas y evite que los tubos se froten entre sí.
4. Añadir 12 μL de muestra de ADN preamplificada a los pocillos apropiados del tubo de tira de PCR. Para el control negativo, añadir 12 μL de MB H₂O.
   NOTA: Analice muestras de ADNcf en pozos replicados. En el caso del líquido cefalorraquídeo, analice al menos por duplicado, y en el caso del plasma/suero, analice cada muestra por triplicado.
5. Pipetear suavemente el volumen completo hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar la mezcla de reacción con la muestra de ADN.
6. Obtenga un nuevo chip de instrumento generador de gotas y pipetee el volumen completo de los pocillos 1 a 8 del tubo de tira de PCR en los canales correspondientes de la A a la H del chip. Evite tocar la parte inferior de los canales con la punta de una pipeta.
7. Obtenga un nuevo tubo de tira de PCR limpio e insértelo en el instrumento generador de gotas. Escanee o introduzca manualmente el ID del chip del instrumento generador de gotas en el software del ordenador del instrumento. Introduzca los nombres de cada uno de los 8 canales. Haga clic en Iniciar la ejecución para comenzar a droptear muestras.
8. Cuando se haya completado la gota, retire el tubo de tira de PCR y aplique las tapas de los tubos de tira.
9. Transfiera el tubo de tira a un termociclador y equilibre con otro tubo de tira que contenga 80 μL de agua por pozo.
10. Programe las condiciones de ciclo térmico como: 95 °C durante 10 min; 45 ciclos de dos temperaturas: 95 °C durante 30 s y temperatura de recocido durante 2 min; 98 °C durante 10 min; y manténgalo a 10 °C.
    1. Ajuste la velocidad de rampa a 0,5 °C/s y el volumen de muestra a 80 μL.
11. Cuando se complete el ciclo térmico, retire el tubo de tira y transfiéralo al instrumento de cuantificación. Retire las tapas de las tiras de PCR y reemplácelas con tapas de alta velocidad.
12. Encienda el instrumento de cuantificación y la computadora conectada con el software del instrumento. Inicie el software del instrumento y haga clic en Configurar una ejecución.
13. Coloque el tubo de tira en el instrumento de cuantificación.
14. Obtenga un nuevo chip de instrumento de cuantificación y escanee o ingrese manualmente la identificación del chip en el instrumento. Inserte el chip en la máquina.
15. Coloque el escudo metálico encima del chip y cierre la tapa del instrumento.
16. En el software del ordenador, introduzca un nombre para la ejecución de dPCR y para cada uno de los 8 canales (A-H). Seleccione Modo rápido (que debe usarse con límites de alta velocidad) y haga clic en Iniciar para comenzar la cuantificación.
17. Una vez completada la cuantificación, retire el blindaje metálico (para guardarlo y reutilizarlo) y deseche el tubo y el chip de la tira de PCR. En el ordenador del instrumento, el registro de ejecución contendrá los archivos de resultados de cada ejecución. Utilice los archivos .fcs de cada muestra para analizarla con el software de análisis.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de consumibles Raindance	Bio-Rad	20-04411	Contiene chips de instrumentos generadores de gotas, chips de instrumentos de cuantificación, tapas de tiras de PCR, incluidas las tapas de alta velocidad, y aceite estabilizador de gotas
Instrumento Raindance Sense	Bio-Rad		Instrumento de cuantificación
Instrumento de fuente Raindance	Bio-Rad		Instrumento generador de gotas
Software RainDrop Analyst II	Tecnologías RainDance		Software de análisis utilizado para el análisis de datos
Termomezclador C	Eppendorf	14 285 562PM
Termociclador MiniAmp	Thermofisher Científico	A37834
Tapas de tubo de tira de pocillos PCR 8	VWR	10011-786
Tubos de tira de pocillos PCR 8	Axygen	PCR-0208-C
Q5 Arranque en caliente de alta fidelidad 2x Mezcla maestra	Nueva Inglaterra Biolabs Inc	M0494S