Preparación de andamios sembrados MSC: una técnica para preparar andamios sembrados con células madre mesenquimales para su implantación quirúrgica en un modelo murino

Resumen

Fuente: Sheets, K. T. et al. Resección guiada por imágenes de glioblastoma e implantación intracraneal de andamios sembrados con células madre terapéuticas. J. Vis. Exp. (2018)

Este video describe la técnica de sembrar células madre mesenquimales (MSCs) en un andamio biodegradable de poli(ácido láctico) (PLA). Los andamios preparados se pueden implantar en la cavidad de resección quirúrgica del cerebro, desde donde pueden migrar hacia los focos tumorales. Además, estas células pueden ser modificadas para expresar proteínas terapéuticas que estimulen la apoptosis en las células cancerosas.

Protocolo

>1. Cultivo celular y preparación de andamios

NOTA: Los andamios deben prepararse 48 h antes de la implantación en ratones. Los siguientes volúmenes se proporcionan por andamio. Multiplique las cantidades según sea necesario para andamios adicionales.

1. Corte los andamios de poli(ácido láctico) (PLA) en piezas del tamaño de una cavidad de resección (aproximadamente 2 mm x 2 mm). Los andamios se pueden cortar a mano con tijeras o con una perforadora para mayor repetibilidad.
2. Esterilizar sumergiendo en etanol al 70% durante 15 minutos seguido de inmersión en PBS. Coloque el andamio en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina mientras prepara las células para la siembra.
3. Levante las MSC cultivadas con tripsina al 0,05 % (3-5 ml para un matraz T75). Incubar a 37 °C durante 5 min. Asegúrese de que las células se hayan levantado, luego agregue 7-10 mL de DMEM al matraz para inactivar la tripsina.
4. Transfiera el contenido del matraz a un tubo de centrífuga de 15 mL. Cuente las células con un hemocitómetro. Pellet 5 x 10⁵ MSCs por cada andamio mediante centrifugación a 100 x g durante 5 min.
5. Aspire el sobrenadante y resuspenda las MSC en 5 μL de DMEM por 5 x 10⁵ células.
6. Prepare los andamios para la siembra secándolos con palmaditas.
   1. Retire un andamio de la inmersión en DMEM con pinzas y colóquelo temporalmente en la tapa de la placa de 6 pocillos. Levante el andamio de la tapa, dejando una gota de exceso de DMEM.
   2. Vuelva a colocar el andamio en la tapa en un lugar nuevo y seco. Repita de 3 a 5 veces, luego coloque el andamio parcialmente seco en una nueva placa de 6 pocillos para sembrar. Repita para cada andamio.
      nota: Un andamio parcialmente seco proporciona resultados óptimos de siembra de células. Si el andamio está demasiado húmedo, las células se deslizarán fuera del andamio y se adherirán a la placa del pocillo que se encuentra debajo. Si el andamio está demasiado seco, la gota no se extenderá por todo el andamio, lo que dará como resultado una mala distribución celular inicial.
7. Con una pipeta, mezcle suavemente el vial de células madre para homogeneizar la suspensión, ya que algunas células pueden haberse asentado en el fondo.
8. Pipetee lentamente 2,5 μL de suspensión MSC recién mezclada directamente sobre el andamio, creando una pequeña gota sobre la parte superior del andamio.
9. Agregue 300 μL de DMEM a los bordes de cada pocillo. Esto evitará la evaporación rápida de la gota de celda. Incubar a 37 °C durante 30 min, permitiendo que las células se adhieran al andamio.
10. Con pinzas, voltee suavemente los andamios en la placa del pocillo. Siembra 2,5 μL de suspensión de MSC recién mezclada (esto da como resultado un total de 5 x 10⁵ celdas sembradas por andamio). Incubar a 37 °C durante 30 min, permitiendo que las células se adhieran al andamio.
11. Cubra los andamios con DMEM agregando 2 mL a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Levante suavemente los andamios para permitir que los medios fluyan por debajo de ellos. Incubar a 37 °C en este estado durante 48 h antes de la cirugía de implantación.
12. Revise los andamios después de 24 h y agregue/cambie el medio si se observa un exceso de evaporación o medios descoloridos debido a un desequilibrio del pH.