Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>1. Resección guiada por fluorescencia e implantación de andamios
NOTA: Esterilizar todas las herramientas antes de iniciar la cirugía.
- Coloque el marco estereotáxico en la platina de un microscopio estereoscópico de disección de fluorescencia.
- Anestesiar al ratón bajo isoflurano inhalado en una cámara de inducción. Una vez anestesiado, asegure el ratón en el marco estereotáxico con un suministro continuo de anestesia inhalada a través de un adaptador de cono nasal de isoflurano. Mantenga la temperatura corporal con una almohadilla térmica y/o una sonda.
NOTA: El isoflurano al 4-5% es adecuado para la inducción y el 2-3% es adecuado para el mantenimiento, pero esto debe adaptarse y controlarse para cada ratón.
- Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar que la córnea se seque. Esterilice el sitio de la incisión del cuero cabelludo con una serie de tres toallitas con alcohol y tres toallitas betadine.
- Realice la prueba de reflejo de pinzamiento de los dedos de los pies en cada extremidad y confirme la respuesta negativa para garantizar una anestesia adecuada. Asegure una frecuencia respiratoria constante a aproximadamente 55-65 respiraciones/min.
- Con pinzas, pellizque y levante suavemente el cuero cabelludo. Realice una incisión rostral-caudal lineal en la línea media con tijeras quirúrgicas. Irrigar el sitio de la incisión con PBS y eliminar la grasa subdérmica con un aplicador de punta de algodón con un movimiento de cepillado circular. Organice la piel de manera que la ventana craneal previamente establecida sea completamente visible.
- Perfore suavemente la duramadre justo en el interior hasta los bordes de la ventana craneal con una aguja de 18G. Repita hasta que la incisión trace completamente el interior de la ventana.
- Extirpa la duramadre despegándola con pinzas finas, revelando el parénquima y el tumor subyacentes.
- Localice el tumor U87 mCh-Fl apagando las luces de la habitación y activando el modo de fluorescencia del microscopio estereoscópico. Prepárese para la resección cargando una punta de pipeta de 1-200 μl en el extremo del tubo de una bomba de vacío.
- Encienda la bomba de vacío. Resecar el tumor aspirando suavemente tejido fluorescente hasta que no quede ninguna señal. Apague la bomba de vacío y deseche la punta de la pipeta. Apague la fluorescencia y vuelva a encender las luces de la habitación.
NOTA: Para controlar el sangrado, irrigar con PBS frío y aplicar una presión constante con un aplicador de punta de algodón. En los casos más graves, la cavidad de resección también se puede taponar temporalmente con un agente hemostático, siempre y cuando se retire después de que se haya detenido el sangrado, seguido de otra irrigación con PBS.
- Inmediatamente antes de la implantación, sumerja lentamente un andamio de PLA sembrado por MSC en PBS para eliminar los medios no deseados y los componentes asociados. Implante el andamio en la cavidad de resección. Si es necesario, agregue 1 μL de fibrinógeno (67-106 mg/mL) seguido de 1 μL de trombina (400-625 U/mL) para asegurar el andamio en su lugar.
- Una vez extraída la duramadre y el colgajo óseo de la ventana craneal ya desechado, selle la herida simplemente cerrando la piel y aplicando pegamento quirúrgico. Retire al animal del anestésico inhalado y déjelo recuperar sobre una superficie caliente.
