Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Etiquetado de células de glioblastoma con construcción FP635 o FP720
- Producir y purificar lentivirus de acuerdo con el protocolo que se describe a continuación:
- Observa los platos sembrados el día 1. Cuando las células son confluentes en un 80-90%, están listas para la transfección.
NOTA: Las células aún deben tener espacio para sufrir 1-2 divisiones celulares
- Prepare la mezcla de plásmidos alícuotas de los cuatro plásmidos en un tubo de 50 ml. Para una preparación de platos de 12 × 15 cm, use 270 μg de vector de transferencia, 176 μg de pMDL (Gag/Pol), 95 μg de pVSVG (glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular) y 68 μg de pREV.
- Prepare 13,5 mL de CaCl2 0,25M (diluido con ddH2O filtrado) y agregue a la mezcla de plásmidos. Añadir 13,5 mL de solución BBS 2×. Mezclar suavemente invirtiendo varias veces e incubar 15 min a temperatura ambiente (22–26°).
- Agregue la mezcla de transfección (untada en gotas) a cada plato (2,25 mL por plato). Agite las placas suavemente e incube a 3% de CO2, 37 °C durante la noche (16-20 h).
- Observa las celdas. Deberían estar llegando a la confluencia. Si un marcador visible (como GFP) está presente en el plásmido lentivector, la eficiencia de la transfección puede evaluarse visualmente. Idealmente, la eficiencia de la transfección debería ser del >90%.
- Retire el medio, agregue 15 mL de DMEM fresco + 2% de FBS a cada plato y transfiera a 10% de CO2, 37 °C. Incubar durante la noche.
- Recoger la primera cosecha de sobrenadante: Recoger y agrupar el sobrenadante (12 platos × 15 ml/plato = 180 ml) de los platos.
- Agregue 15 mL de DMEM fresco + 2% FBS a cada plato. Incubar las placas al 10% deCO2, 37 °C durante la noche. El recipiente que contiene el sobrenadante lentiviral debe colocarse en una contención secundaria (una bolsa de plástico sellada servirá) y almacenarse a 4 °C.
- Concentrar la preparación viral: Concentrar las partículas virales por ultracentrifugación. Centrifugar el sobrenadante a 70.000 x g durante 2 h a 20 °C. Se recomiendan tubos cónicos (en lugar de tubos de fondo redondo) y rotores de cubo oscilantes (en lugar de rotores de ángulo fijo) (simplemente porque esta combinación hace que la pelletización casi invisible sea más fácil de localizar). Utilizamos tubos cónicos con un rotor Beckman SW28 (capacidad para seis tubos) a 19.400 r.p.m. durante 2 h a 20 °C. Llene los tubos con 30 mL de sobrenadante. El volumen total de sobrenadante de una preparación de plato de 12 × 15 cm es de 360 mL; Por lo tanto, procesar el volumen completo requerirá dos giros consecutivos. Cargue los tubos, haga el primer giro, vierta el sobrenadante sin perturbar la bolita, recargue con sobrenadante viral fresco y realice el segundo giro.
- Vierta el sobrenadante y deje que el líquido restante se drene apoyando los tubos invertidos sobre toallas de papel. Extrae las gotas restantes con un aspirador para eliminar todo el líquido de la pellet. El pellet debe ser apenas visible como una pequeña mancha translúcida.
- Vuelva a suspender los gránulos virales en 100 μL de HBSS de 1×. Evite hacer espuma. Enjuague los tubos con 100 μL de HBSS al 1×. Agrupar ambos volúmenes para obtener un volumen final de 200 μL.
- Transfiera a un tubo de microfuga con tapón de rosca, envuélvalo en parafilm y vórtice a baja velocidad durante 15-30 minutos. La preparación viral resuspendida tendrá un aspecto que va desde claro hasta ligeramente lechoso.
- Despeje la suspensión girando durante 10 s en una microcentrífuga de mesa. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfuga con tapón de rosca nuevo. Hacer 20 μL de alícuotas del sobrenadante. Este sobrenadante viral es de calidad in vitro.
- Cultivo de aproximadamente 2,0 x 106 células de una línea celular de glioma humano con DMEM más 10% de suero fetal bovino (FBS) en una placa de 15 cm; o cultivo de 2,0 x 106 esferas de glioblastoma humano derivado de pacientes (GBM-PDX) con medio DMEM/F12 1:1 con suplemento de B27 más factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF; 20 ng/mL) y FGF (10 ng/mL) en un matraz T75.
- Mantenga todas las celdas a 37 °C, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa.
- Disociar las células.
- Para las células de glioma: retire el sobrenadante de las placas y agregue 3-5 mL de tripsina 1X a las células de glioma.
- Para las esferas GBM: recoja las células pipeteándolas en un tubo de 15 ml.
- Gire las esferas GBM a 200 x g durante 5 minutos con una centrífuga de mesa a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante y agregue de 3 a 5 ml de solución de desprendimiento de células.
- Incubar todas las células a 37 °C durante 10-15 min.
- Disocie cuidadosamente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces (asegúrese de que las esferas y las células de glioma estén completamente disociadas) y gire hacia abajo a 200 x g durante 5 minutos.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 5 mL de medio pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Determinar la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano.
- Placa de 1,0 x 106 células diana en una placa de 10 cm con 5 mL de medio por pipeteo.
- Transducir células con lentivirus que expresan proteínas fluorescentes en la multiplicidad de infección (MOI) 5 e incubar a 37 °C.
- Después de 24 h, retire el medio de las células transducidas, agregue 5 mL de medio fresco e incube durante 48 h adicionales a 37 °C.
- Disocie las células infectadas en una suspensión de una sola célula utilizando tripsina como se describe anteriormente. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min y volver a suspender en 500 μL de solución clasificadora (solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 1% de FBS).
- Pipetear la suspensión celular en tubos FACS. Teñir las células con 1 μL/mL de diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para excluir las células muertas. Se requieren controles negativos para configurar las puertas del citómetro de flujo (celdas no transducidas y celdas no transducidas / teñidas con DAPI).
- Clasifique las células fluorescentes positivas/DAPI negativas en una solución de clasificación y recoja las células clasificadas en un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar las células clasificadas a 200 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y volver a suspender en 5 mL de medio de cultivo. Siembre las células clasificadas en un plato de 10 cm mediante pipeteo. Incubar a 37 °C durante al menos 48-72 h.
- Expanda las celdas ordenadas disociando las celdas como se describió anteriormente y colocándolas en múltiples placas para experimentos in vivo.
