Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1.FMT Imágenes
NOTA: De acuerdo con el objetivo experimental, las células de glioblastoma marcadas con iRFP pueden monitorizarse in vivo antes, durante o después del tratamiento. Para fines de imagen, anestesiar a los animales utilizando una cámara de inducción de isoflurano, mantenerla en un casete de imágenes durante la exploración y obtener imágenes en la estación de acoplamiento del generador de imágenes FMT.
- Retirar al animal de la jaula y colocarlo en la cámara de inducción de isoflurano. Cierra la cámara y enciende el flujo de oxígeno y el vaporizador al 3-5%.
- Vigile al animal hasta que esté completamente anestesiado, generalmente dentro de 1 a 2 minutos. Los animales inconscientes no deben responder a estímulos externos.
- Retire el animal anestesiado de la cámara y colóquelo en el casete de imágenes colocando primero el adaptador de cabeza, seguido de la colocación del animal boca abajo. Asegúrese de que el cabezal esté ubicado en el centro del casete.
- Coloque la placa superior del casete en la parte superior y apriete las perillas de ajuste hasta 17 mm.
- Una vez que el animal esté seguro en el casete de imágenes, proceda a la obtención de imágenes insertando el casete en la estación de acoplamiento interna del generador de imágenes FMT, donde se bombea el isoflurano para mantener al animal anestesiado.
- Ejecute el software del generador de imágenes y del analizador haciendo doble clic en el icono del software.
- En la ventana "Pestaña Experimental", seleccione la "Base de datos" y el "Grupo de estudio".
- Vaya a la ventana "Pestaña Escanear" y seleccione el tema de la imagen haciendo clic en "seleccionar sujeto". Además, seleccione el canal láser en el panel "Canal láser". Para las celdas marcadas con FP635, seleccione "canal láser 635 nm", y para las celdas etiquetadas con FP720, seleccione "canal láser 680 nm".
- Adquiera una imagen haciendo clic en la opción "Capturar" en la ventana "Pestaña Escanear". A continuación, ajuste el campo de escaneo haciendo clic y arrastrando el campo de escaneo en la imagen capturada a un número determinado de ubicaciones de origen, normalmente dentro de 20-25 fuentes para el lado ipsilateral.
- Marque la opción "Agregar a la cola de reconstrucción" y presione "Escanear" en la ventana "Pestaña Escanear".
- Espere hasta que se complete el escaneo y, a continuación, retire el casete de imágenes de la estación de acoplamiento.
- Retire la placa superior del casete y vuelva a colocar al animal en la jaula.
- Repita los pasos 1.1 a 1.12 para el resto de los animales.
>2. Análisis de imágenes
- En el software de generación de imágenes y analizador, seleccione la ventana "Pestaña Análisis".
- Cargue el conjunto de datos y el tema a analizar haciendo clic en el botón "+" en el panel "Selección de conjunto de datos" de la ventana de la pestaña "Análisis".
- Una vez cargada la imagen en la ventana de la pestaña "Análisis", realice el análisis de la región de interés (ROI) seleccionando el icono del elipsoide, situado en la esquina superior izquierda de la ventana de la pestaña "Análisis".
- Ajuste el umbral a cero en el panel "datos estadísticos" haciendo clic con el botón derecho en la columna "umbral" en la ventana de la pestaña "Análisis".
- El valor total en el panel "Datos estadísticos" representa la señal de las células de glioblastoma marcadas con fluorescencia implantadas en el cerebro del ratón.
- Repita los pasos 2.2 y 2.4 para el resto de los animales. Cargue o elimine un nuevo tema haciendo clic en el botón "+" o "-", respectivamente, en el panel "Selección de conjunto de datos" de la ventana "Pestaña Análisis".
