Ensayo de migración de células madre de tumores cerebrales (BTSC) para estudios de tratamiento de fármacos: una técnica de imagen de células vivas in vitro para analizar el efecto del tratamiento con fármacos en la migración de BTSC

Resumen

Fuente: Restall, I. et al. Ensayos de imágenes de células vivas para estudiar la migración e invasión de células madre de tumores cerebrales de glioblastoma. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, realizamos un ensayo de migración de células madre de tumores cerebrales para analizar el efecto del fármaco de interés en la migración de células madre de tumores cerebrales vivos utilizando la placa de migración de quimiotaxis. Las imágenes de células vivas facilitan la visualización y cuantificación de la migración celular durante el ensayo.

Protocolo

1. Ensayo de Migración de Células Madre de Tumores Cerebrales

1. Siembre 200.000 células en un matraz T25 en 8 mL de medio completo 1-2 semanas antes de planificar la realización de un ensayo de migración.
   nota: El tiempo transcurrido entre la siembra y la realización del ensayo variará en función de la tasa de crecimiento del cultivo BTSC utilizado.
   1. Para probar el efecto de un tratamiento farmacológico en la migración, se deben tratar previamente las células con el vehículo adecuado, como el DMSO, y el fármaco de interés añadiendo los volúmenes aplicables del vehículo o del stock de fármacos directamente en pocillos separados de medios que contengan las células.
2. Prepare la placa de migración de quimiotaxis (Figura 1A) recubriéndola con una capa delgada de colágeno.
   1. Calcule el número de pocillos de una placa de quimiotaxis de 96 pocillos que deberán recubrirse con colágeno. Incluya al menos tres pozos replicados para cada condición.
   2. Diluir 5 mg/mL de caldo de colágeno tipo I a 0,2 mg/mL en ácido acético puro diluido al 0,14% en agua de grado de cultivo.
   3. Pipetear 0,2 mg/mL de colágeno tanto en los pocillos de inserción de membrana como en los pocillos de reservorio de fondo que se están utilizando.
      nota: Los depósitos inferiores de la placa requieren 225 μL y los pocillos de inserción de membrana requieren 75 μL de colágeno para un recubrimiento adecuado.
   4. Coloque la placa de migración en una incubadora a 37 °C durante 1 h. Aspire la solución de colágeno de los pocillos sin rayar la capa de colágeno.
   5. Lave los pocillos 2 veces con PBS estéril 1x. Si la placa no se utiliza de inmediato, aspire el PBS y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 2 semanas. Antes de usar, caliente la placa de migración de quimiotaxis a temperatura ambiente.
3. Prepare el depósito inferior de la placa de migración de quimiotaxis.
   1. Pipetea 225 μL de medio (sin factores de crecimiento), suplementado con un 10% de FBS como quimioatrayente, hasta los pocillos del reservorio inferior de la placa de migración de quimiotaxis.
   2. Coloque suavemente el inserto de membrana en el depósito inferior en ángulo para evitar la creación de burbujas.
4. Coloque las células en el inserto de membrana de la placa de migración de quimiotaxis.
   1. Resuspenda las BTSC disociadas en medios (sin factores de crecimiento) a una densidad celular de 50.000 células/mL. Agregue drogas a los medios de comunicación si evalúa la migración durante diferentes tratamientos con drogas. Alternativamente, siembre el mismo número de células pretratadas y células de control, mientras mantiene la concentración final del fármaco durante la siembra.
   2. Coloque 50 μL de las BTSC del paso 1.4.1 en cada pocillo de la placa de migración en las condiciones de tratamiento deseadas.
5. Imagen de la migración de quimiotaxis.
   1. Coloque la placa de migración de quimiotaxis en el sistema de imágenes de células vivas y configure el software de imágenes automatizado para adquirir imágenes microscópicas de la placa cada 1-2 h durante un máximo de 72 h. Utilizando un software comercial (consulte la Tabla de materiales), haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo y establezca el intervalo de escaneo cada 2 h durante 24 h.
      nota: El intervalo de tiempo y el tiempo total transcurrido variarán entre los cultivos BTSC utilizados; comience con intervalos de 2 h durante 72 h hasta que se haya adquirido experiencia con cultivos BTSC individuales. Si no se dispone de un sistema de imágenes automatizado, se pueden adquirir imágenes del mismo campo de visión manualmente con un microscopio y una cámara conectada al software de imágenes.
   2. Una vez completada la adquisición de la imagen, obtenga las imágenes de todo el experimento y cree una definición de procesamiento utilizando el software de análisis que diferencie las células del fondo de la membrana y los poros de migración (Figura 1B, máscara roja). Utilizando software comercial (consulte la Tabla de materiales), seleccione una Nueva definición de procesamiento y establezca la configuración de la definición de procesamiento para BTSC en un umbral de inicialización de 52, un umbral de crecimiento de 85, ajustes del tamaño (píxeles) en -1 y un área mínima de 200 μm². Aplique esta definición de procesamiento a la parte inferior de la membrana. Modifique este análisis si no distingue con precisión las células de la membrana de fondo.
   3. Recopile datos como el área de la superficie celular en la parte inferior de la membrana para cada uno de los tres pocillos replicados, que solo cuenta las células que han migrado a través de los poros. Grafique la migración de las células en μm² (área de células migradas) a lo largo del tiempo (Figura 1C).
      nota: Asegúrese de que el número relativo de células sembradas y contadas en la superficie superior de la membrana en el primer punto de tiempo sea similar (menos del 20% de variación en todos los pocillos) entre todas las condiciones de tratamiento para evitar cualquier efecto de una siembra desigual. La recopilación de datos utilizando el software comercial (ver Tabla de materiales) se puede ejecutar iniciando la definición de procesamiento creada en el paso 1.5.2, haciendo clic en Métricas, luego en Gráfico/exportación y luego en Exportación de datos.

Resultados

Figura 1: Imágenes de células vivas de una migración de BTSC. (A) Este es un ejemplo de una placa de migración de quimiotaxis de 96 pocillos recubierta con una capa delgada de colágeno tipo I antes de realizar el ensayo de migración con BTSC. Las imágenes muestran i) una placa con las tres partes (tapa, inserto de membrana y depósito) colocadas juntas, ii) las tres p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matriz Matrigel	Corning	356230
Placas de 96 pocillos	Eppendorf	30730119
T25 Nunc EasYFlask	ThermoFisher	156367
Tubo cónico Falcon 15 mL	ThermoFisher	352096
Placa de quimiotaxis Incucyte ClearView de 96 pocillos	Essen Bioscience	4582
Sistema de análisis de células vivas IncuCyte Zoom	Essen Bioscience	4545
Software de análisis de células vivas IncuCyte Zoom	Essen Bioscience	2016A Rev1
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	sigma	D8537
Agua de grado de cultivo	Lonza BioWhittaker	17-724Q
Suero fetal bovino (FBS)	Invitrogen	12483-020
Colágeno de Rata I	Trevigen	3440-100-01
Solución de desconexión de celdas Accumax	Tecnologías celulares innovadoras	AM105