1. Ensayo de invasión de la neurosfera con células madre de tumores cerebrales
- Siembre 200.000 células en 8 mL de medio completo en un matraz T25 1-2 semanas antes de planificar la realización de un ensayo de invasión.
nota: El tiempo desde la siembra hasta la realización del ensayo dependerá de la tasa de proliferación del cultivo BTSC utilizado.
- En el caso de las células pretratadas, añada el compuesto de interés al matraz a la concentración deseada durante el curso de tiempo predeterminado antes de que las neuroesferas estén listas para ser cubiertas para la invasión.
- Espere hasta que el tamaño promedio de la neurosfera sea de aproximadamente 150-200 μm; por lo general, esto toma de 7 a 14 días, dependiendo del cultivo de BTSC que se utilice.
nota: Es típico observar una distribución de tamaños de esferas en el matraz.
- Inclinar y mezclar suavemente el matraz con una pipeta y mover 500 μL de las neuroesferas BTSC a un tubo cónico de 1,5 mL para cada condición de tratamiento; esto se utilizará para recubrir tres pocillos replicados.
NOTA: Los pasos 1.3.1 a 1.3.2 son opcionales, pero se recomiendan para el primer experimento de invasión en una nueva cultura BTSC.
- Para determinar la densidad de las neuroesferas que terminarán en el pozo, prepare un tubo de 1,5 mL como en el paso 1.3. Mezcle suavemente las neuroesferas y mueva 100 μL en una placa separada de 96 pocillos y deje que las neuroesferas se asienten por gravedad durante 5 minutos.
- Verifique el número de neuroesferas bajo el microscopio para asegurarse de que haya múltiples neuroesferas en la región del pozo que se tomará sin abarrotarlo.
nota: Las neurosferas invasoras requieren suficiente espacio para triplicar su diámetro sin interactuar con las neurosferas vecinas. El número de neuroesferas por pocillo se puede ajustar contando el número de neuroesferas por pocillo y añadiendo más o menos neuroesferas del matraz T25 al tubo cónico de 1,5 mL en el paso 1.3.
- Coloque el tubo cónico de 1,5 ml con las células del paso 1.3 en hielo y realice los pasos 1,5 a 1,7 en hielo.
- Deje que las neuroesferas se asienten por gravedad en el fondo del tubo cónico de 1,5 ml durante 5 minutos y enfríe previamente una placa etiquetada de 96 pocillos en hielo.
- Resuspender las neuroesferas en la proteína de la matriz extracelular.
- Prepare 500 μL de una solución de colágeno tipo I de 0,4 mg/mL en hielo para cada condición de tratamiento: agregue 459 μL de medio (sin factores de crecimiento), 40 μL de la solución madre de colágeno de 5 mg/mL y 0,92 μL de NaOH 1N estéril (Tabla 1).
NOTA: Se requieren 500 μL de la solución de colágeno por condición de tratamiento: 100 μL para cada uno de los tres pocillos replicados y 200 μL de exceso. Los tratamientos farmacológicos deben añadirse aquí a la concentración final deseada, restada del componente medio de la solución. Este protocolo describe el uso del colágeno tipo I como proteína de la matriz extracelular; sin embargo, cualquier proteína de la matriz extracelular puede ser analizada. Además, para los cultivos BTSC que tienen tasas más lentas de invasión, se pueden complementar factores de crecimiento o FBS en los medios para aumentar la tasa de invasión.
- Después de que las neuroesferas del paso 1.5 se hayan asentado, aspire la mayor cantidad posible de medios sin perder la bolita de neurosfera que se ha asentado en la parte inferior. Resuspender suavemente las neuroesferas en 500 μL de la solución de colágeno preparada en el paso 1.6.1.
- Agregue 100 μL de la mezcla de colágeno y neurosfera a tres pocillos replicados de la placa de 96 pocillos en hielo. Deje que las neuroesferas se asienten en hielo durante 5 minutos.
- Transfiera la placa de 96 pocillos a una incubadora a 37 °C durante 5 minutos para permitir la polimerización del colágeno.
- Prepárese inmediatamente para obtener una imagen de la placa de 96 pocillos.
- Coloque la placa de 96 pocillos en la bandeja de un sistema de imágenes de células vivas o en la platina de un microscopio para adquirir una imagen como referencia para el tamaño de la neurosfera en el momento de la siembra, antes de que comience la invasión.
- Adquiera imágenes cada hora hasta que la tasa de invasión se haya estabilizado; por lo general, esto ocurre dentro de las 24 h.
nota: El intervalo de imagen se puede modificar en función del equipo que se utilice. El intervalo de imagen y el tiempo total transcurrido también se pueden modificar para cultivos BTSC que tienen diferentes tasas de invasión.
- Determine el aumento del área de superficie de las BTSC a medida que invaden la matriz con el tiempo.
nota: El área de superficie de las células en el momento de la siembra, calculada como la media de tres pocillos replicados, debe ser similar (menos del 20% de variación en todos los pocillos) entre las diferentes condiciones de tratamiento para garantizar que las diferencias en la invasión de BTSC no se vean fuertemente afectadas por el número o el tamaño de las neuroesferas plachadas.
- Para el sistema de análisis de células vivas, utilice un objetivo 10X para la adquisición de imágenes y adquiera cuatro imágenes por pocillo para los tres pocillos replicados. Para determinar el área relativa de la superficie de la celda, representada como el porcentaje de confluencia del pozo, configure una definición de procesamiento que resalte específicamente las celdas sobre el fondo del pozo. Utilizando software comercial (consulte la Tabla de materiales), seleccione una Nueva definición de procesamiento y establezca el ajuste de segmentación en 0,8, el área mínima en 300 μm2 y la excentricidad máxima en 0,99. Modifique este análisis si no distingue con precisión las celdas del fondo.
nota: Si se utilizan otros métodos para obtener imágenes de la invasión de la neurosfera a lo largo del tiempo, se recomienda obtener múltiples campos de visión para los tres pozos replicados a lo largo del tiempo. Sin embargo, no obtener imágenes exactas del mismo campo de visión en cada intervalo aumentará el error estándar de los datos recopilados. Se puede utilizar un software informático para ayudar a medir la superficie de las células invasoras en cada imagen.
- Recopile datos como el área total de la superficie de la celda (ya sea relativa o absoluta) para cada pozo en cada punto de tiempo y determine la media de los tres pozos replicados. Grafique la invasión de BTSC trazando el aumento del área celular a lo largo del tiempo.
| Preparación de la solución de colágeno |
| Stock [Colágeno] (mg/mL) | 5 |
| Final [Colágeno] (mg/mL) | 0.4 |
| Número de pozos necesarios: | 5 |
| Volumen total (μL) | 500 |
| Volumen de colágeno (μL) | 40 |
| Volumen de NaOH 1N (μL) | 0.92 |
| Volumen del medio (μL) | 459 |
Tabla 1: Preparación de la solución de colágeno tipo I de 0,4 mg/mL. Se enumeran las concentraciones iniciales y finales conocidas de la solución de colágeno tipo I. Los volúmenes enumerados son suficientes para colocar neuroesferas en tres pocillos replicados, más dos para el exceso, y pueden incluir una sola condición de tratamiento, como se describe en detalle en el paso 1 del protocolo.
