Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de las diapositivas estampadas
- Preparación del sustrato para el micropatrón
- Trate los cubreobjetos circulares de vidrio de 18 mm mediante activación por aire/plasma durante 5 min. Coloque los cubreobjetos en una cámara cerrada con 100 μL de (3-aminopropil) trietoxisilano en un desecador durante 1 h.
- Incubar con 100 mg/mL de valerato de poli (etilenglicol)-succinimidilo (peso molecular 5.000 (Peg-SVA)) en tampón de carbonato de 10 mM, pH > 8, durante 1 h. Enjuague abundantemente con agua ultrapura y seque bajo una cubierta química.
nota: En esta etapa, la muestra se puede almacenar a 4 °C en la oscuridad para su uso posterior.
- Agregue el fotoiniciador, cloruro de 4-benzoil-benzoilo trimetilamonio (PLPP), a 14,7 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
nota: También se puede utilizar una forma concentrada de PLPP, un gel de PLPP. El resultado es un tiempo de iluminación ultravioleta (UV) más corto necesario para degradar el cepillo PEG (100 mJ/mm2).
- Deposición de gel fotoiniciador
- Prepare una mezcla de 3 μL de gel PLPP y 50 μL de etanol absoluto para depositar en el centro del portaobjetos. Coloque la muestra bajo una cubierta química hasta la evaporación completa del etanol absoluto.
nota: En esta etapa, la muestra se puede almacenar a 4 °C en la oscuridad para su uso posterior.
- Micropatrón de portaobjetos de vidrio
- Monte el cubreobjetos en una cámara Ludin y colóquelo en la platina motorizada de un microscopio equipado con un sistema de enfoque automático.
- Cargue las imágenes correspondientes a los micropatrones previstos en el software. Aplique estos parámetros: replicación 4 x 4 veces, espaciado de 200 μm, dosis UV de 1.000 mJ/mm2. Después de la secuencia automática de iluminación UV, enjuague el PLPP con varios lavados PBS.
nota: Si se utilizó gel PLPP, retírelo mediante lavados extensos con agua desionizada, seque en un chorro de N2 y almacene a 4 °C.
- Incubar con laminina (50 μg/mL en PBS) durante 30 min. Lavar abundantemente con PBS.
NOTA: Una solución fluorescente de proteína verde fluorescente purificada (GFP, 10 μg/mL en PBS) se puede mezclar con laminina para visualizar los micropatrones mediante microscopía de fluorescencia.
>2. Preparación de neuronas y células GBM para cocultivo
- Cultivo de neuronas embrionarias de hipocampo de rata
- Diseccionar el hipocampo de ratas embrionarias (E18) y transferir el tejido a una solución salina balanceada de Hank (HBSS)/1 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico (HEPES)/penicilina-estreptomicina en un tubo de 15 mL. Retire el exceso de solución sin secar el hipocampo.
- Añadir 5 mL de ácido tetraacético de tripsina-etilendiamina (EDTA) suplementado con penicilina (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) y 1 mM de HEPES, e incubar durante 15 min a 37 °C. Lavar 2 veces con la solución de HBSS/HEPES/penicilina-estreptomicina, y dejar que el tejido permanezca en esta solución durante 2-3 min.
- Disocie el tejido con dos pipetas Pasteur pulidas con llama, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces con cada tejido, teniendo cuidado de minimizar la formación de espuma. Cuente las células y evalúe la viabilidad de la suspensión celular. Coloque las neuronas en cubreobjetos micropatrados como se indica a continuación.
nota: La tasa de viabilidad celular es del 85-90% después de la extracción.
- Cultivo celular de neuronas en cubreobjetos micromodelados
- Rehidrate portaobjetos de vidrio microestampados con PBS e incube un medio de cultivo de células neuronales completo.
- Siembre las neuronas del hipocampo obtenidas de ratas E18 Sprague-Dawley directamente sobre el cubreobjetos de vidrio micropatrón a una densidad de 50.000 células porcm2 en medio neurobasal (NBM) enriquecido con suero de caballo al 3%. Coloque las neuronas micromodeladas en la incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 48 h.
nota: Después de ~ 6 h, se pueden ver las neuronas primarias del hipocampo adhiriéndose a los micropatrones de laminina.
- Cocultivo de células madre humanas de GBM en neuronas
- A medida que las células en forma de esferoide crecen en suspensión, centrifugar la suspensión durante 5 minutos a 200 × g. Lavar los esferoides con 5 mL de PBS e incubar las células con 0,5 mL del reactivo de disociación celular (ver Tabla de Materiales) durante 5 min a 37 °C.
- Añadir 4,5 mL de NBM completo (complementado con suplemento de B27, heparina, factor de crecimiento de fibroblastos 2, penicilina y estreptomicina, como se ha descrito anteriormente) y contar las células mediante una técnica de recuento automático.
- Siembra 1.000 células GBM sobre el cultivo neuronal micromodelado en NBM enriquecido con un 3% de suero de caballo. Incubar la placa a 37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad.
