Aislamiento y cultivo de pericitos cerebrales primarios: un procedimiento para aislar y cultivar pericitos de capilares cerebrales bovinos sin contaminación de células endoteliales

En este artículo

Resumen

Fuente: Hørlyck, S. et al. Cultivo de pericitos capilares cerebrales para mediciones de calcio citosólico y estudios de imágenes de calcio.J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos el procedimiento para aislar y cultivar pericitos de capilares cerebrales bovinos sin contaminación de células endoteliales.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Siembra y cultivo de capilares bovinos

Día 0: Mezclar 0,7 mL de caldo de colágeno IV con 6,3 mL de PBS. Añadir la solución a un matraz T75 y dejar el matraz durante 2 h a temperatura ambiente (RT) o dejarlo toda la noche a 4 °C.
Retire la solución de colágeno del matraz y lave tres veces con PBS.
Añadir 7 mL de solución de trabajo de fibronectina y dejar el matraz durante 30 min en RT. A continuación, retire la solución de fibronectina y siembre los capilares inmediatamente después.
Durante el tiempo de espera de 30 minutos, descongele un vial de capilares en un baño de agua a 37 °C.
Cuando los capilares estén descongelados, transfiéralo inmediatamente a un tubo de centrifugación con 30 mL de DMEM-comp y centrifugue durante 5 min a 500 x g y RT. Retire DMEM-comp del tubo y vuelva a suspender el pellet capilar en 10 mL de DMEM-comp fresco.
Transfiera la suspensión de 10 mL al matraz T75 recubierto y deje que los capilares se adhieran al fondo del matraz durante 4-6 h en una incubadora a 37 °C al 10% de CO₂,
nota: La tasa de crecimiento celular es mayor con un 10% de CO₂ en lugar del convencional 5% de CO₂.
Después de 4-6 h de incubación, inspeccione el matraz bajo un microscopio óptico. Las fracciones de los capilares deben estar ahora unidas al fondo del matraz (Figura 1, día 0).
Prepare el medio GM y aspire el medio DMEN-comp con mucho cuidado de los capilares y reemplácelo con 10 mL de GM recién hecho.
Día 2: Retire la transgénico de los capilares y reemplácela con 10 ml de transgénico recién hecho. El crecimiento celular de los capilares debe ser visible bajo un microscopio óptico en este punto (Figura 1, día 2-3).

>2. Aislamiento de Pericitos Primarios de Capilares Cerebrales Bovinos

Día 4: Inspeccione los capilares bajo un microscopio óptico.
nota: El matraz debe tener ahora aproximadamente un 60-70% de confluente para proporcionar una cantidad adecuada de pericitos (Figura 1, día 4). Si este no es el caso; reemplace el GM con 10 mL de medio fresco y deje el matraz en la incubadora para otro día.
Aspire el medio y lave las células suavemente en PBS.
Añada 2 ml de tripsina-EDTA descongelada para las células endoteliales y deje el matraz en la incubadora durante 1-3 minutos. Saque el matraz con frecuencia y observe con el microscopio durante este período de tiempo.
nota: Las células endoteliales deben redondearse y desprenderse del matraz; Los pericitos deben ser visibles como células con una morfología "fantasma" y aún así estar adheridos a la superficie del matraz, este es un paso complicado e importante.Es esencial eliminar la mayoría de las células endoteliales para evitar la contaminación del monocultivo de pericitos, pero la tripsinización prolongada también puede desprender los pericitos. El tiempo de tripsinización puede variar ligeramente de vez en cuando, por lo que es de suma importancia observar el matraz con frecuencia con el microscopio durante el tratamiento.
Golpee suavemente el matraz, cuando las células endoteliales hayan comenzado a redondearse, para separar las células endoteliales aflojadas.
Para detener la tripsinización, añada 10 mL de DMEM-comp al matraz. Enjuague el matraz cuidadosamente unas cuantas veces con el medio para eliminar las células endoteliales. Aspire la suspensión de células endoteliales del matraz. Las células endoteliales ahora se pueden utilizar para otros fines.
Añada 10 mL de DMEM-comp al matraz. Mire debajo del microscopio óptico para asegurarse de que los pericitos aún estén presentes y adheridos a la parte inferior. Vuelva a colocar el matraz en la incubadora para permitir que crezca el cultivo enriquecido con pericitos.
nota: Es importante observar la cultura durante los días siguientes. Si todavía hay un buen número de células endoteliales en crecimiento, se puede realizar otro tratamiento con tripsina.
Permita que el monocultivo de pericitos crezca con el cambio de medio DMEM-comp. cada dos días. Verifique el crecimiento de las células bajo el microscopio óptico (Figura 1, día 5-8).

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Resultados

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Figura 1: Cultivo de capilares y aislamiento de pericitos.Los capilares se han aislado del cerebro fresco de bovino y se han sembrado en matraces de cultivo el día 0. El crecimiento de los capilares cerebrales bovinos y el posterior aislamiento de los pericitos se siguieron durante días con un microscopio óptico. El día 4a muestra el crecimiento de las células endoteliales antes del tratamiento con t...