Aislamiento de capilares cerebrales del cerebro humano: un método optimizado para extraer capilares cerebrales del tejido cerebral humano

Resumen

Fuente: Hartz, A. M. S. et al. Aislamiento de Capilares Cerebrales a partir de Tejido Cerebral Humano Fresco. J. Vis. Exp. (2018)

Este video presenta el aislamiento de capilares cerebrales de un tejido cerebral humano fresco. Los capilares aislados se pueden utilizar para generar un modelo de barrera hematoencefálica ex vivo.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Preparación de muestras de cerebro

NOTA: La Figura 1A muestra el gráfico de flujo de trabajo de todo el procedimiento de aislamiento que se describe a continuación. El tejido cerebral humano puede provenir de cualquier parte de la corteza y se puede utilizar fresco o congelado. El tejido cerebral congelado se puede descongelar a temperatura ambiente (sin tampón; ~30 min para 10 g). Para lograr resultados comparables, el tejido cerebral debe obtenerse de la misma región cerebral para cada experimento. Este protocolo está optimizado para la corteza cerebral humana fresca (intervalo post-mortem o PMI <4 h) que no ha sido congelada.

1. Preparación del tejido encefálico humano: Documentar el peso del tejido encefálico. Todos los números del siguiente protocolo son apropiados para 10 g de tejido cerebral humano fresco. Coloque el tejido cerebral en una placa de Petri de 100 mm. Retire cuidadosamente todas las meninges con fórceps. Usa un bisturí para cortar la materia blanca.
2. Picado del tejido cerebral humano: Cortar cuidadosamente el tejido cerebral y picarlo con un bisturí. Pica durante unos 5 minutos (trozos de 2 a 3 mm). Transfiera el tejido cerebral al triturador de tejidos Potter-Elvehjem. Agregue 30 mL de tampón de aislamiento.
   nota: Los trozos de tejido picado son difíciles de ver ya que el tejido cerebral se convierte en papilla a través del proceso de picado.

2. Homogeneización

1. Trituradora de tejidos Potter-Elvehjem (holgura: 150–230 μm): Homogeneizar cada muestra con 100 golpes a una velocidad de homogeneizador de 50 rpm. Documente el tiempo cada 25 trazos y el tiempo total necesario para 100 golpes. Véase la Tabla 1 para un protocolo de homogeneización propuesto; El tiempo total para homogeneizar 10 g de corteza frontal humana es de unos 22 min. No revuelva en el aire para evitar burbujas.
2. Homogeneizador Dounce (aclaración: 80–130 μm): Transfiera el homogeneizado a un homogeneizador Dounce en hielo. Homogeneice la suspensión con 20 carreras (~6 s/carrera, un total de ~2 min). Evita las burbujas.

>3. Centrifugación

1. Distribuya el homogeneizado cerebral por igual en cuatro tubos de centrifugación de 50 mL y documente el volumen total del homogeneizado. Distribuya 50 mL de tampón de gradiente de densidad en los tubos de centrifugación (12,5 mL por tubo). Utilice 10 ml de tampón de aislamiento para enjuagar el mortero y el homogeneizador y distribúyalo en los cuatro tubos de centrifugación (~2,5 ml por tubo).
2. Cierre herméticamente los tubos de la centrífuga con tapas, mezcle el medio homogeneizado con gradiente de densidad y tampón agitando vigorosamente los tubos. Centrífuga a 5.800 x g durante 15 min a 4 °C (rotor de ángulo fijo); Seleccione una velocidad de desaceleración media para mantener el pellet unido al tubo. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet en 2 mL de BSA al 1%.

>4. Filtración

NOTA: Para separar los capilares de los glóbulos rojos y otros desechos celulares, son necesarios varios pasos de filtración.

1. Malla de 300 μm: Después de volver a suspender el pellet, filtre la suspensión a través de la malla de 300 μm. Los capilares se filtran a través de la malla, mientras que los vasos más grandes y los desechos cerebrales más grandes permanecen en la malla. Lave cuidadosamente la malla con hasta 50 mL de BSA al 1%. Descarte el archivo mesh.
   nota: Este paso de filtración limpia la suspensión capilar de cualquier vaso más grande o trozos de desechos cerebrales.
2. Filtro de deformación celular de 30 μM
   nota: Este paso de filtración separa los capilares de los glóbulos rojos y otros desechos cerebrales.
   1. Distribuya el filtrado capilar del paso 4.1 sobre los cinco filtros de deformación celular de 30 μm (aproximadamente 10 mL de filtrado capilar por filtro de deformación celular). Los capilares son retenidos por este filtro, mientras que los glóbulos rojos, otras células individuales y pequeños restos cerebrales pasan a través del filtro y se recogen en el filtrado.
   2. Lave cada filtro con 25 mL de BSA al 1%. A continuación, vierta todos los filtrados sobre el sexto filtro para aumentar el rendimiento. Lave cada filtro con 50 mL de BSA al 1%; Mantenga los filtros de deformación celular que contengan los capilares y deseche el filtrado.

5. Colección capilar

1. Dé la vuelta a los filtros y lave los capilares con 50 mL de BSA al 1% por cada filtro en tubos de 50 mL. Aplique suavemente presión con la punta de la pipeta de una pipeta de 5 ml y muévala a través del filtro para lavar los capilares cerebrales.
2. Asegúrate de lavar todos los capilares cerebrales, especialmente del borde del filtro. Evite las burbujas, ya que esto dificulta el proceso de filtración y aumenta la posibilidad de pérdida capilar.

6. Lavado

1. Después de recoger los capilares, centrifugar todas las muestras a 1.500 x g durante 3 min a 4 °C (rotor de cubo oscilante). Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en aproximadamente 3 mL de tampón de aislamiento. Combine todos los gránulos resuspendidos de una muestra en un tubo cónico de 15 ml y llénelo con tampón de aislamiento. Centrifugar de nuevo a 1.500 x g durante 3 min a 4 °C y lavar dos veces más.
2. Documente la pureza capilar con un microscopio (aumento de 100X) y una cámara (Figura 1B).
   nota: El rendimiento capilar cerebral de 10 g de tejido cerebral humano suele ser de unos 100 mg. Los capilares cerebrales aislados ahora se pueden usar para experimentos, procesar (por ejemplo, lisado, aislamiento de membrana) o congelarse rápidamente y almacenarse a -80 °C en criotubos durante un mínimo de 6 a 12 meses (evite múltiples ciclos de congelación y descongelación).

años años años

Trazos	Hora
De 1 a 25	7–7,5
De 26 a 50	5–5,5
De 51 a 75	5–5,5
76–100	5–5,5
Tiempo total:	22–24 minutos

Tabla 1: Protocolo de homogeneización. El protocolo de homogeneización para la trituradora de tejidos Potter-Elvehjem para homogeneizar 10 g de corteza frontal humana a una velocidad de homogeneización de 50 rpm. Tenga en cuenta que los primeros trazos requieren tiempo adicional para homogeneizar el tejido picado. Después de esta homogeneización inicial, cada trazo tiene una duración de 12 s (6 s para el movimiento hacia abajo, 6 s para el movimiento hacia arriba). Por lo tanto, después de la homogeneización inicial, se pueden realizar 5 golpes en 1 minuto, o 25 golpes en 5 minutos.

Resultados

Figura 1: Diagrama de flujo para el aislamiento capilar. (A) El pictograma ilustra los pasos principales del procedimiento para aislar los capilares cerebrales del tejido humano fresco. (B) La imagen muestra capilares cerebrales humanos aislados bajo un microscopio óptico directamente después del aislamiento (aumento de 100X).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Equipos de protección individual (EPP)
Guantes de látex Diamond Grip Plus, Microflex Medium	VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos	32916-636	EPI
Batas protectoras desechables	VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos	470146-214	EPP; debido a la naturaleza del material de origen humano, se recomienda el uso de una bata de laboratorio desechable
Protector facial, desechable	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	19460102	EPP; debido a la naturaleza del material de origen humano, se recomienda el uso de un protector facial desechable
Materiales de seguridad
Bolsas para autoclave de alta temperatura Clavies 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	01-815-6
Papel de banco seco Versi 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	14-206-32	Para cubrir áreas de trabajo
Sistemas de contenedores para objetos punzantes de VWR	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	75800-272	Para bisturíes usados
Lejía 8.2% Clorox Germicida 64 oz.	Centro de suministros del Reino Unido, Lexington, KY, EE. UU.	323775
Equipo
4 °C Refrigerador	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	Teléfono 13-986-148
Medidor de pH Accume BASIC AB15	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	AB15
Control Heidolph RZR 2102	Heidolph, Elk Grove Village, Illinois, Estados Unidos	501-21024-01-3
Centrífuga Sorvall LEGEND XTR	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	75004521
Microscopio de disección Leica L2	Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, Illinois, EE. UU.		Se utiliza para extirpar las meninges
Homogeneizador POLYTRON PT2500	Kinematica AG, Lucerna, Suiza	9158168
Escala P-403	Denver Instrument, Bohemia, Nueva York, Estados Unidos	191392
Mini agitación estándar	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	1151050
Termo-Frascos Nitrógeno Líquido Dewar	Thermal Scientific, Mansfiled, TX, EE. UU.	11-670-4C	Se utiliza para congelar el tejido
Balanza analítica Voyager Pro	OHAUS, Parsippany, Nueva Jersey, Estados Unidos	VP214CN
Microscopio ZEISS Axiovert	Carl Zeiss, Inc Thornwood, Nueva York, Estados Unidos		Se utiliza para comprobar capilares aislados
Herramientas y cristalería
Finnpipette II Pipeta 1-5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	21377823T1	Lave los capilares del filtro
Finnpipette II Pipeta 100-1.000 μL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	21377821T1	Resuspender pellet en BSA
Chico pipeta	Integra, Hudson, NH, Estados Unidos	739658
50 mL Tubos Falcon 25/rack - 500/cs	VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos	21008-951
Hojas de bisturí EISCO	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	S95938C	Para picar tejido cerebral
PARAFILM	VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos	52858-000	Para cubrir el vaso de precipitados y el matraz aforado
Thermo Scientific Puntas de pipeta Finntip 5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	Teléfono 21-377-304	Para lavar los capilares del filtro
Jeringa de 60 ml con Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.	BD309653	Se utiliza con el anillo conector para filtrar los capilares
Mango de bisturí #4	Herramientas de Bellas Ciencias, Foster City, CA, EE. UU.	10060-13	Se utiliza para picar
Pinzas Dumont #5	Herramientas de Bellas Ciencias, Foster City, CA, EE. UU.	11251-10	Se utiliza para extirpar las meninges
Potter-Elvehjem Trituradora de pañuelos	Thomas Scientific, Swedesboro, Nueva Jersey, EE. UU.	3.43E+28	50 mL volumen, aclaramiento: 150-230 μm
Homogeneizador Dounce	VWR, Radnor PA EE. UU.	62400-642	Volumen de 15 mL, aclaramiento: 80-130 μm
Filtros tejidos Spectra/Mesh (300 μm)	Spectrum Laboratories, Rancho Domínguez, CA, EE. UU.	146424	Se utiliza para filtrar la suspensión capilar para eliminar las meninges que puedan quedar
pluriStrainers (tamaño de poro: 30 μm)	pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemania	43-50030-03
Anillo conector	pluriSelect Life Science, Leipzig, Alemania	41-50000-03	Reutilizar varias veces
Matraz aforado de 1 L			Para la preparación del tampón de aislamiento
Vaso de precipitados de 1 L			Para la preparación de BSA al 1%
Barra de agitación			Para la preparación de 1% BSA y Ficoll®
Frasco Schott (60 mL)			Para la preparación de Ficoll®
Cubo de hielo			Para mantener todo frío
Placa de Petri de 100 mm			Para picar el tejido cerebral
Raspador de células de cultivo de tejidos	VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos	89260-222	Para eliminar el sobrenadante después de la centrifugación
Productos químicos
BSA Fracción V, A-9647	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	A9647-500g	Prepárese en DPBS con Ca2+ y Mg2+ el día anterior. Evite las burbujas durante la preparación. Guárdelo en el refrigerador. Revuelva lentamente durante 10 minutos antes de usar.
DPBS con Ca2+ y Mg2+	Hyclone	SH30264.FS	DPBS: parte del búfer de aislamiento
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	F4375	La medición exacta es importante aquí. Pesar en botella con barra para revolver. Agite enérgicamente después de agregar DPBS. Conservar en la nevera O/N. Estará despejado por la mañana. Revuelva suavemente durante 10-15 minutos antes de usar. Mantener en hielo hasta su uso.
Glucosa (D-(+) Dextrosa)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	G7528	Concentración de glucosa (D-(+) dextrosa): 5 mM
Solución estándar de hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	71474	Para ajustar el pH del DPBS
Piruvato de sodio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	Página 2256	Concentración: 1 mM