Zimografía de péptidos fluorescentes: una técnica modificada para detectar la actividad de la proteasa utilizando sustratos fluorogénicos en geles de zimograma

Resumen

Fuente: Deshmukh, A. A. et al. Detección de la actividad de la proteasa mediante zimografía de péptidos fluorescentes. J. Vis. Exp. (2019)

En este video, realizamos zimografía, una técnica electroforética, para analizar la actividad proteolítica dentro de muestras biológicas.

Protocolo

1. Electroforesis de muestras biológicas en geles de zimografía peptídica

1. Disuelva las muestras en un tampón de muestra de zimografía convencional (62,5 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 25% glicerol, 4% SDS, 0,01% azul de bromofenol). Para muestras de células y tejidos, se recomiendan ~30 μg de proteína total por pocillo, y 50-100 ng de proteína para los estándares MMP.
2. Agregue 400 mL de 1x Tampón de Running Tris-Glycine SDS al aparato de gel. Cargue hasta 35 μL de muestra por pocillo. Deje correr las muestras a 120 V a 4 °C durante 1,5 horas o hasta que los estándares de peso molecular indiquen que las proteasas de interés están dentro de la capa de gel que resuelve péptidos (que tiene un color naranja visible).
   nota: La mayoría de los MMP y sus variantes se encuentran dentro del rango de 35 a 100 kDa. Cuando los estándares de peso molecular indican que esos pesos están dentro de la capa de gel que resuelve péptidos, se puede detener la electroforesis. El mismo principio se puede aplicar a otras clases de proteasas con pesos moleculares conocidos. Si hay interés en detectar múltiples proteasas en un rango más amplio de pesos moleculares, reduzca el tamaño de la capa de gel resolutivo y aumente el tamaño de la capa de gel resolutivo de péptidos.
3. Después de la electroforesis, retire los geles del casete de plástico y lave los geles tres veces durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente bajo una agitación suave en un tampón de renaturalización que contiene 2,5% de Triton X-100, 1 μM de ZnCl₂ y 5 mM de CaCl₂ en 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5.
4. Transfiera los geles a una solución tampón en desarrollo que contenga 1% de Triton X-100, 1 μM de ZnCl₂ y 5 mM de CaCl₂ en 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5 durante 15 min. Reemplácelos con una solución tampón de revelado fresca e incube los geles a 37 °C bajo agitación suave durante 24 horas, asegurándose de que los geles estén completamente sumergidos en la solución.
5. Después de 24 horas, la imagen se gelifica utilizando un escáner/generador de imágenes de gel fluorescente utilizando los filtros de excitación y emisión adecuados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Casetes de gel vacíos de 1,5 mm	ThermoFisher Scientific	NC2015
Solución SDS del 20%	Ambiente	AM9820
3x Tampón de muestra de zimografía	Bio-Rad	1610764
Kit Azido-PEG3-Maleimida	Haga clic en Herramientas de química	AZ107
Fuente de alimentación básica PowerPac	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Estándar de doble color	Bio-Rad	161-0374
Agujas hipodérmicas PrecisionGlide	Fisher Científico	Teléfono 14-826