Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Sistema de ultrasonido focalizado
NOTA: La configuración descrita es un sistema de interrupción BBB construido internamente basado en componentes disponibles comercialmente e incluye un cono hecho a medida impreso en 3D y una plataforma estereotáctica desmontable. El sistema está diseñado de forma modular, lo que facilita las modificaciones de acuerdo con los equipos disponibles y el uso específico. El protocolo describe el procedimiento para la sonoporación de un área más grande en la región pontina del cerebro del ratón. Al ajustar la ubicación del objetivo, se podrían apuntar a diferentes partes del cerebro. En este estudio, se utilizó un transductor monoelemento de 1 MHz con una distancia focal de 75 mm, una apertura de 60 mm y un área focal de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de presión máxima). El plano focal del transductor se coloca a través del cráneo del animal en el plano horizontal que se cruza con las barras de la oreja.
- Seleccione un transductor apropiado para la apertura de BBB en roedores.
nota: En función de las propiedades de las microburbujas y la frecuencia empleada, los ajustes acústicos, en particular el índice mecánico (IM), están sujetos a cambios.
- Coloque el transductor en el cono impreso en 3D.
- Emplee una membrana de mylar acústicamente transparente en el extremo inferior del cono para lograr el acoplamiento acústico de la trayectoria de propagación del haz y llene el cono con agua desgasificada.
- Monte el transductor sobre el animal en una etapa lineal motorizada como se muestra en la Figura 1, lo que permite el posicionamiento vertical automático del transductor.
- Diseñar una plataforma estereotáctica desmontable basada en los requisitos del estudio, que incluya calefacción regulada por temperatura, barras de mordida y orejas, anestesia y marcadores fiduciales multimodales, como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. El montaje de la plataforma estereotáctica consiste en un sistema de escenario lineal 2D, que permite un posicionamiento automático preciso (< 0,1 mm) del animal debajo de la viga.
- Conecte el transductor a la cadena de emisión acústica que se muestra en la Figura 1, que consta de un transductor, un generador de funciones y un amplificador de potencia.
- Diseñar una línea de procesamiento de imágenes para detectar los marcadores fiduciales multimodales que permiten la sonoporación precisa del área cerebral de interés y la recopilación de los datos de cavitación detectados por el hidrófono de aguja.
- Calibrar el sistema y determinar el punto de enfoque del transductor en correspondencia con la posición vertical del animal en la plataforma estereotáctica.
>2. Preparación animal
NOTA: El siguiente protocolo está especificado para ratones, pero se puede adaptar para ratas. Para estos experimentos se utilizaron ratones hembra atímicos desnudos Foxn1-/- (de 6 a 8 semanas de edad).
- Permita que el animal se aclimate durante al menos una semana en las instalaciones para animales y pese al animal con regularidad.
- Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por inyección subcutánea (s.c.) 30 min antes del tratamiento con FUS para iniciar el tratamiento analgésico.
- Anestesiar al animal con isoflurano al 3%, 2 L/minO2 y verificar que el animal esté profundamente anestesiado. Mantenga a los animales anestesiados durante todo el procedimiento y controle la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca para ajustar la concentración de isoflurano según sea necesario.
- Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad ocular y evitar posibles lesiones.
- Eliminar el vello de la parte superior de la cabeza con una navaja de afeitar y crema depilatoria y lavar después con agua para eliminar cualquier residuo y evitar irritaciones en la piel.
- Para experimentos con modelos tumorales BLI, inyecte 150 μL de D-luciferina (30 mg/mL) intraperitoneal (i.p.) con una jeringa de insulina 29G para la guía por imágenes BLI.
- Inserte un catéter de vena de cola de 26 a 30 G y enjuague el catéter y la vena con un pequeño volumen de solución de heparina (5 UI/ml). Llene el catéter con solución de heparina para evitar la coagulación de la sangre.
nota: Un buen cateterismo se observa cuando hay un reflujo de sangre hacia el catéter. Evite las burbujas de aire en el catéter para prevenir émbolos. Para evitar una presión excesiva de inyección, asegúrese de que la longitud del catéter sea lo más corta posible.
- Coloque al animal en la plataforma estereotáctica regulada por temperatura para evitar la hipotermia.
nota: La hipotermia reduce la circulación sanguínea, lo que puede afectar a la inyección/circulación de microburbujas y a la farmacocinética de los fármacos.
- Inmovilizar y fijar la cabeza del animal en la plataforma estereotáctica utilizando barras para las orejas y una barra de mordida. Fija el cuerpo con una correa y pega la cola del animal a la plataforma.
3. Ultrasonido focalizado guiado por imágenes in vivo
NOTA: Para este protocolo se utilizó un transductor monoelemento de 1 MHz con un pulso de ráfaga de tono con una duración de 10 ms, una MI de 0,4 y una frecuencia de repetición de pulso de 1,6 Hz con 40 ciclos durante 240 s. El protocolo está optimizado para microburbujas estabilizadas por fosfolípidos que contienen hexafluoruro de azufre (SF6) como gas inocuo, donde el diámetro medio de la burbuja es de 2,5 μm y más del 90% de las burbujas son menores de 8 μm.
- Coloque la plataforma estereotáctica con el animal montado en la modalidad de imágenes (p. ej., BLI o rayos X) y tome imágenes del animal.
- Utilice los marcadores de referencia multimodales en combinación con la tubería de procesamiento de imágenes para marcar la posición del animal de acuerdo con el punto de enfoque del transductor.
- Determine el área objetivo colocando un contorno cerebral sobre la imagen de rayos X adquirida o utilizando imágenes BLI para determinar el centro del tumor (Figura 2). La posición de partes específicas del cerebro se especifica en el Atlas del Cerebro de Paxinos utilizando las marcas del cráneo bregma y lambda como puntos de referencia. Por ejemplo, el pons se encuentra x=-1.0, y=-0.8 y z=-4.5 de lambda.
- Proteja las fosas nasales y la boca del animal con cinta adhesiva para evitar que el gel de ultrasonido interfiera con la respiración.
- Aplique gel de ultrasonido en la parte superior de la cabeza del animal.
- Retraiga la piel del cuello de los animales, lubrique el hidrófono de la aguja con gel de ultrasonido y coloque el hidrófono de la aguja en las proximidades directas del hueso occipital.
- Guíe el transductor a la posición correcta utilizando la tubería de procesamiento de imágenes y el punto de enfoque.
- Aplique los ajustes preconfigurados a todos los dispositivos conectados y diríjase a la región del cerebro de interés.
nota: Dependiendo de la pregunta de investigación, las regiones tumorales o cerebrales se pueden sonoporar como un solo punto focal o como forma volumétrica, como se muestra en la Figura 2.
- Active las microburbujas según lo descrito por el fabricante. Inyecte un bolo de 120 μL (5,4 μg) de microburbujas.
- Enjuague el catéter de la vena de la cola con solución salina para verificar la apertura del catéter.
- Inyecta las microburbujas e inicia la insonación.
- Registre la cavitación de microburbujas con el hidrófono de aguja.
- Administrar un agente de contraste intravascular o fármaco después de la sonoporación. La dosis, el momento y la planificación dependen del propósito del estudio y del fármaco.
nota: El azul de Evans es un agente de color común para evaluar la apertura BBB.
- Monitoree al animal hasta el punto de tiempo predeterminado o antes del punto final humanitario.
