Entrega de genes basada en electroporación en el útero: una técnica para inyectar ADN plasmídico en células cerebelosas embrionarias de embriones murinos

Resumen

Fuente: Feng W. et al. Análisis de Pérdida de Función Mediado por CRISPR en Células Gránulas Cerebelosas Utilizando Transferencia de Genes Basada en Electroporación In Utero. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra la entrega de ADN plasmídico en células neuronales cerebelosas de embriones murinos utilizando electroporación en el útero. Este método es útil para comprender la función in vivo de los genes en el desarrollo normal del cerebro y los cambios en la expresión génica de las células neuronales durante la progresión tumoral.

Protocolo

1. Realizar electroporación en el útero

1. Cría ratones de 6 a 8 semanas de edad y prepara las herramientas para la electroporación en el útero. Cruce de ratones homocigotos machos Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP con ratones hembra CD-1. Cronometrar el embarazo de los ratones CD-1 desde el día en que se detecta el tapón vaginal (E0.5). Los embriones se electroporan en el día E13.5.
   1. Tire de los capilares de vidrio de borosilicato (diámetro interior: 0,6-0,8 mm) con un extractor de micropipetas. Utilice los siguientes ajustes: P = 500, Calor = 560, Tirar = 150, Vel = 75, Tiempo = 250. Etiquete la punta capilar con tinta negra para una mejor visualización durante la inyección. Recorte el cono capilar bajo un microscopio estereoscópico con una regla y pinzas de aguja afiladas y recorte la punta a una longitud de unos 6 mm.
   2. Mantener la unidad de los capilares para que el experimento sea reproducible. Cree un borde biselado de un solo lado durante el recorte. La punta debe ser lo más afilada posible para facilitar la penetración de la pared uterina y evitar daños en los tejidos del embrión.
      nota: Alternativamente, use un micromolinillo para ajustar un ángulo de 35°. Los capilares se pueden almacenar a temperatura ambiente en una placa de Petri de 10 cm en condiciones libres de patógenos.
   3. Autoclave los instrumentos quirúrgicos.
   4. Mezcle los plásmidos de sgRNA en partes iguales con pT2K-IRES-Luc hasta una concentración final de al menos 1 μg/μL para cada plásmido y coloree la solución de plásmido con verde rápido (concentración final de 0,05%). Prepare una solución madre verde rápida al 1% con agua destilada libre de endotoxinas y filtre a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar las partículas de tinte de la solución><. nota: La co-transfección de pT2K IRES-Luc es opcional, pero permite la identificación de animales electroporados viables después del nacimiento utilizando imágenes de bioluminiscencia. Prepare una cantidad suficiente de mezcla de plásmidos para el número total de ratones preñados que se van a operar. Utilice una mezcla de 15-20 μL por ratón (~12 embriones). Proceda inmediatamente con la cirugía.
2. Preparar a los ratones para la cirugía
   1. Anestesiar ratones CD-1 preñados con isoflurano. Inducir la anestesia en una caja con 3-4 vol-% de isoflurano (caudal de oxígeno: 1,5 L/min) y mantenerla con 2-vol-% durante la cirugía a través del cono nasal.
      nota: La cirugía completa no debe durar más de 30 minutos. Reducir el número de embriones inyectados y electroporados, si es necesario. Utilice guantes estériles para la cirugía.
   2. Coloque el mouse boca arriba sobre una almohadilla térmica y ajuste la anestesia.
   3. Inyectar analgésico (Metamizol, 800 mg/kg de peso corporal, por vía subcutánea (s.c.), depósito de 24 h)
      nota: Puede utilizar otros analgésicos autorizados además de Metamizol.
   4. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad ocular durante la cirugía.
   5. Fije las extremidades con cinta adhesiva y esterilice el abdomen con un desinfectante. Cubra el ratón con una gasa, dejando solo expuesta el área quirúrgica. Extienda etanol al 70% sobre el área quirúrgica y la gasa.
   6. Haga una incisión en la piel de unos 2 cm de largo y ensanche el espacio suavemente con unas tijeras quirúrgicas rectas. Localice la línea alba y haga una segunda incisión ligeramente más pequeña a través del peritoneo con unas tijeras de tejido con punta roma.
   7. Humedecer la cavidad abdominal abierta con 1x PBS estéril precalentado.
   8. Extraiga cuidadosamente los cuernos uterinos de la cavidad abdominal con pinzas de anillo. Tire suavemente agarrando la pared uterina únicamente en el espacio entre los sacos vitelinos de dos embriones vecinos. Evite cualquier presión sobre el embrión mientras tira de él a través de la incisión. Amplíe la incisión si es necesario y tenga especial cuidado de colocar los cuernos uterinos en el abdomen sin comprimir el flujo sanguíneo a través de la arteria uterina.
      nota: En algunos casos, se aconseja extraer un cuerno uterino a la vez y reemplazarlo antes de proceder con el segundo cuerno uterino.
3. Inyección y electroporación de ADN plasmídico
   1. Aspire aproximadamente 15 μL de solución plásmida coloreada con el capilar de vidrio preparado. Evite las burbujas de aire durante este proceso.
      nota: La solución plásmida puede obstruir la punta fácilmente si su concentración es alta. Pruebe el capilar liberando algo de ADN justo antes de la inyección.
   2. Sujete suavemente el embrión con pinzas de anillo y localice el área del cuello.
      nota: Si el embrión está en una posición difícil para inyectar, sáltelo y vaya a por el siguiente embrión. El aumento de la reposición del embrión puede aumentar las posibilidades de que se dañen.
   3. Perforar lentamente con la punta del capilar de vidrio previamente preparado en el cuarto ventrículo penetrando a través del cerebro posterior dorsal y posteriormente inyectar aproximadamente 1 μL de la mezcla de plásmidos. Confirme que el ADN teñido no se filtra del cerebro y es visible como una estructura en forma de diamante><. nota: Como opción, use lupas de 2.5 pliegues para una mejor visualización del cuarto ventrículo y los vasos sanguíneos circundantes. Administra impulsos eléctricos inmediatamente después de la inyección para evitar la difusión de la solución plasmídica a los otros ventrículos.
   4. Aplique pulsos cuadrados eléctricos (5 pulsos, 32 mV, 50 ms-encendido, 950 ms-apagado) con pinzas de platino tipo pinza (ver Tabla de Materiales). Coloque los electrodos lateralmente con el polo negativo cubriendo el oído y el polo positivo colocado en el primordio cerebeloso sobre la pared uterina. Utilice placas de electrodos de 5 mm de diámetro para una electroporación eficaz de embriones E13.5.
      nota: Aumentar la tasa de supervivencia de las crías manipulando^{menos de 2}/3 del número total de embriones por madre. Evite los embriones demasiado cerca del cuello uterino. Si se manipulan, pueden causar complicaciones durante el parto y poner en peligro a toda la camada. Si los electrodos están demasiado cerca del corazón del embrión, esto puede causar un paro cardíaco.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Banda de autoclave	Kisker Biotech	150262
Porador Electro Cuadrado	BTX	ECM830
Endofree Maxi Kit	Qiagen	12362
etanol	Merck	107017
Ungüento para los ojos (Bepanthen)	Bayer	81552983
Verde rápido	Merck	104022
Filtro (0,22 μm)	Merck	F8148
Pinzas rectas	Herramientas de Bellas Ciencias	91150-20
Gasa (X100 ES-almohadillas 8f 10 x 10 cm)	Fisher Científico	15387311
Capilar de vidrio con filamento	Narishige	GD1-2
Almohadilla térmica	ThermoLux	463265 / -67
Isoflurano	Zoetis	TU061219
Pinzas de anillo	Herramientas de Bellas Ciencias	11103-09
Microscopio estereoscópico	Nikon	C-PS
Tijeras quirúrgicas	Herramientas de Bellas Ciencias	91460-11
Tijeras quirúrgicas con punta roma	Herramientas de Bellas Ciencias	14072-10
Pinzas con electrodos de disco de 5 mm Platino	Xceltis GmbH	CUY650P5
Metamizol	Wdt
Hilo de sutura de seda no estéril (0,12 mm)	Herramientas de Bellas Ciencias	18020-50
PBS (1x)	Tecnologías de la Vida	14190169
Tijeras de pañuelo Blunt (11,5 cm)	Herramientas de Bellas Ciencias	14072-10
pCAG-EGxxFP	Addgene	50716
Plásmido pX330	Addgene	42230