Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de los ratones y cirugía
NOTA: En este estudio se utilizan ratones C57BL/6J machos y hembras de 8 semanas de edad. Las condiciones de la cirugía siguen las reglas de la IACUC de nuestra institución. Los instrumentos se esterilizan, la superficie de trabajo quirúrgica se desinfecta, el animal se desinfecta y el cirujano usa guantes estériles.
- El día antes de la cirugía, anestesia al ratón con isoflurano al 2% y luego retire el pelaje a lo largo del fémur en el lado dorsal con una navaja fina o un agente químico depilatorio.
- El día de la cirugía, anestesiar a los ratones con isofluorano al 2% en una cámara de inducción. Confirmar la anestesia mediante un estímulo de pellizco en el dedo del pie y falta de respuesta.
- Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad bajo anestesia.
- Coloque el ratón anestesiado en su lado ventral y asegure suavemente cada extremidad con cinta hipoalergénica para crear una tensión leve en la extremidad que se va a inyectar. La anestesia se mantiene utilizando isoflurano administrado a través de un vaporizador de precisión y un cono nasal.
- Limpie el lugar de la inyección con Betadine, y luego nuevamente con alcohol al 70%. Repite este proceso dos veces más. Asegúrese de que no quede pelo suelto en el campo quirúrgico.
- Realice una incisión de 1 cm con unas tijeras pequeñas a unos 2 mm por debajo y paralelas al fémur. Retraiga la piel con pinzas lateralmente para exponer los músculos que se encuentran debajo.
- El nervio ciático se extiende profundamente a los músculos glúteo mayor y bíceps femoral. Separe estos dos músculos a lo largo de un plano fascial con tijeras pequeñas y exponga el nervio ciático debajo. Libere el nervio de los músculos circundantes mediante una disección roma.
- Extraiga 3 μL de células cancerosas (alrededor de 50,000 células) del gránulo en una jeringa de 10 μL.
nota: Alternativamente, extraiga 3 μL de PBS como control.
- Coloque una pequeña espátula de metal debajo del nervio en el punto de inyección como soporte. Bajo visualización con un microscopio de disección, inserte la aguja en el nervio contra la base metálica, manteniendo la aguja lo más paralela posible al nervio después de la inserción. Tenga cuidado de no perforar la parte posterior del nervio. Minimice el manejo del nervio tanto como sea posible a lo largo de este proceso.
- Inyecte lentamente en el nervio durante 5 s. La formación de un bulbo en el área de inyección indica una buena inyección. A continuación, deje la aguja en su lugar durante 3 segundos antes de retirarla suavemente. Mantener la aguja en su lugar durante 3 segundos minimiza el reflujo de las células fuera del nervio.
nota: La inyección se puede realizar hacia el nervio distal o la médula espinal. Es importante mantener la coherencia dentro de un conjunto de experimentos. Si las células se derraman al exterior, el animal no debe incluirse en el análisis del experimento. Con la experiencia, estos eventos son muy raros.
- Vuelva a colocar el nervio en su posición original. Cubre el nervio con los músculos suprayacentes. Trate a los ratones con analgesia adecuada y luego cierre la piel con suturas de nailon 5-0.
- Coloque al ratón solo en una jaula limpia para observarlo durante la recuperación, hasta que despierte completamente de la anestesia.
nota: El animal tarda entre 5 y 15 minutos en recuperar la conciencia plena. El animal no se deja desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. El animal no se devuelve a la compañía de otros animales hasta que se recupere por completo. A partir de entonces, evalúe la recuperación al menos una vez cada 24 h durante 72 h.
