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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Extracción del nervio ciático
- Tomemos ratones a los que se les inyectaron previamente células cancerosas en los nervios ciáticos y les practicamos la eutanasia con CO2. Coloque el ratón sobre su lado ventral y estabilice las extremidades distales con alfileres.
- Retire la piel de la parte dorsal de la extremidad inyectada y el torso.
- Usando una disección roma, exponga el nervio ciático profundamente en los músculos.
- El nervio fluye entre el ilion y el sacro. Para tener acceso al nervio en la región de la médula espinal, separe los dos huesos. Primero, inserte las tijeras cerradas en el área estrecha donde se encuentra el nervio ciático y luego abra las tijeras mientras sostiene el mouse. Sea delicado y mantenga la integridad del nervio ciático durante la disección.
- Diseccionar cuidadosamente el nervio ciático distalmente hasta el final del fémur y proximalmente a la médula espinal.
nota: Los nervios invadidos son extremadamente frágiles y propensos a romperse bajo tensión o manipulación forzada.
- Extrae el nervio cortando primero su extremo distal. Levante con cuidado el nervio mientras lo libera del tejido adyacente. Corta el nervio en el extremo proximal, lo más cerca posible de su salida de la columna vertebral.
- Registre la longitud bruta de la invasión utilizando un calibrador Vernier. Esta estimación macroscópica es solo orientativa.
>2. Procesamiento y cuantificación de nervios
- Incrustar el nervio disecado en el compuesto OCT. Asegúrate de colocar los nervios longitudinalmente y lo más planos posible en la parte inferior del molde.
- Indique en el casete el lado proximal y distal del nervio marcando la letra P (proximal) y D (distal).
- Coloque los nervios incrustados encima del hielo seco, si no se seccionan inmediatamente. La muestra pudo conservarse a -80 °C durante varias semanas.
- Corte las muestras con un micrótomo criostato de 5 μm de espesor y coloque las secciones en portaobjetos de vidrio. Si es posible, coloque dos secciones de nervios por portaobjetos. Indica el lado proximal del nervio.
- Portaobjetos de tinción con tinción H&E.
- Escanee digitalmente secciones nerviosas manchadas con un escáner de portaobjetos que proporciona datos digitales de alta resolución.
- Con el uso de software de imágenes, cuantifique la longitud de la invasión haciendo clic en el botón medir la distancia, el área de invasión u otros parámetros deseados. Para una buena estimación de la duración de la invasión, use múltiples secciones (2 a 4) del mismo nervio.