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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparar ratones para la inyección de células tumorales
- Anestesiar a un ratón mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de cóctel de ketamina/xilacina (ketamina 100 mg/kg, xilacina 10 mg/kg).
- Confirme la anestesia completa pellizcando las patas del animal y observe la falta de respuesta.
- Coloque el ratón sobre una placa de vidrio (utilizada para fundir geles de proteínas) y asegúrelo con bandas elásticas.
- Si es necesario, elimine el vello del cuello afeitando o aplicando una pequeña cantidad de producto depilatorio y limpiando el vello con una toalla de papel.
nota: Si usas ratones desnudos, omite este paso ya que no tienen vello corporal.
- Limpie la piel del cuello aplicando povidona yodada y alcohol al 70%.
- Coloque el ratón en la platina del microscopio de disección
- Haga una incisión en la piel de ~ 1 cm de largo con un bisturí quirúrgico.
- Diseccione sin rodeos el músculo con pinzas dentadas para exponer la arteria carótida que se encuentra debajo.
- Separe la arteria carótida del nervio vago adyacente con pinzas quirúrgicas.
- Con pinzas quirúrgicas, separe un poco de algodón de una bola de algodón, humedezca y forme una bola de algodón más pequeña. Coloque esta bola de algodón humectada con tampón debajo de la arteria carótida del sitio de inyección previsto.
- Coloca una sutura distal y proximal al algodón y haz nudos sueltos. Apriete el nudo proximal para bloquear el flujo sanguíneo en el lugar de la inyección.
- Proceda a la inyección de células cancerosas si la arteria carótida de la bola de algodón parece estar completamente presurizada con sangre roja fresca.
>2. Inyección de células cancerosas en la arteria carótida
- Realice un vórtice y extraiga 100 μL de células cancerosas en la jeringa.
- Bajo el microscopio de disección, inserte lentamente la aguja 31G (con el bisel hacia arriba) en la luz de la arteria carótida que se encuentra encima de la bola de algodón.
- Inyecte lentamente las células de la jeringa en la arteria carótida. El éxito de la inyección se puede observar bajo el microscopio por el cambio de color de los vasos sanguíneos cercanos y la musculatura cuando las células cancerosas amortiguadas se introducen en la circulación.
- Cuando se complete la inyección de todo el volumen, levante suavemente la arteria carótida distal para prevenir la regurgitación.
- Apriete rápidamente el nudo distal para completar el proceso de inyección.
- Después de completar la inyección, apriete las ligaduras y recorte el exceso de sutura de seda con microtijeras bajo el microscopio de disección. Mueva hacia atrás el músculo separado para cubrir el sitio de la herida. Cierre la piel con dos grapas.
>3. Recuperación quirúrgica
- Mueva al animal operado a una almohadilla térmica para recuperarlo. Los animales pueden tardar entre 30 y 60 minutos en recuperar la conciencia. Mientras tanto, administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por inyección subcutánea como analgesia postquirúrgica.
nota: La analgesia debe proporcionarse de acuerdo con el protocolo local aprobado por la IACUC.
- Una vez que los animales despierten y reanuden su comportamiento normal, devuelva los ratones a su lugar de alojamiento. Proporcione a los ratones alimento en gel durante varios días después de la cirugía. Mantenga un registro quirúrgico y guárdelo en la habitación.
>4. Imágenes in vivo no invasivas
- En el caso de las células marcadas con construcciones reporteras de luciferasa, mida la eficiencia de la inyección de células cancerosas utilizando un sistema de imágenes in vivo.
nota: Las imágenes no se realizan el día de la inyección para evitar un estrés excesivo en los animales de investigación.