Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Inyectar la suspensión tumoral en el cuarto ventrículo de un embrión de 2-dpf
- Transfiera de 10 a 20 embriones decorionados anestesiados a la periferia de la placa de inyección utilizando una pipeta de transferencia; los embriones deben caer lateralmente sobre la placa de inyección, con los ventrículos claramente visibles y accesibles. Use una sonda en ángulo para ajustar los embriones según sea necesario y colóquelos lejos del borde exterior de la placa de inyección.
- Cargue 1–2 μL de la suspensión de células tumorales en la aguja de inyección utilizando puntas de pipeta de carga de gel e inserte la aguja en el manipulador.
- Baje manualmente el manipulador, sosteniendo la aguja en un ángulo de 45°. Ajuste las perillas del micromanipulador en las direcciones x, y y z hasta que la aguja esté justo por encima y aproximadamente 5 mm a la derecha de la cabeza del embrión. Mire a través de los oculares del microscopio estereoscópico y ajuste lentamente el micromanipulador en la dirección x hasta que la aguja perfore el cuarto ventrículo del embrión. No permita que la aguja perfore el corazón o la yema.
- Presione el pedal conectado al microinyector para inyectar la suspensión de células tumorales.
nota: La presión y el tiempo de inyección variarán según el tamaño del orificio de la aguja, pero un buen punto de partida es de 5 a 10 PSI y de 50 a 100 ms. El volumen de las células tumorales inyectadas se puede evaluar con técnicas estándar de gotas de aceite a través de la inyección en aceite mineral, si se desea. Las inyecciones de 500 pL con un diámetro de gota de 0,1 mm suelen dar los mejores resultados.
- Enjuague suavemente los embriones inyectados de la placa de inyección y colóquelos en una placa de Petri con agua de huevo fresca (0,6 g/L de sal de acuario en agua de ósmosis inversa + 0,01 mg/L de azul de metileno). Mantenga los embriones en agua de huevo para los procedimientos restantes o hasta que crezcan en tanques.
- Inspeccionar los embriones inyectados bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Confirmar que la presión de inyección, el ángulo, el tamaño de la aguja y la viscosidad de la suspensión celular dan como resultado que las células tumorales llenen el 25-50% del espacio del ventrículo. Ajuste estos parámetros según sea necesario.
- Repita los pasos 1.1 a 1.5 para los embriones restantes. Anestesiar los embriones adicionales según sea necesario.
nota: Una usuaria experimentada puede inyectar hasta 300 embriones en 3-4 h.
- Vuelva a colocar los embriones en la incubadora a 28 °C durante la noche.
- Al día siguiente, evalúe la supervivencia del embrión examinando las características morfológicas y fisiológicas, como el desarrollo normal del corazón y el cerebro, como se describe.
