Administración intranasal de células madre neurales terapéuticas (NSC) en un modelo murino: un procedimiento para la administración dirigida al tumor de NSC cargadas con virus oncolíticos en un modelo de ratón portador de tumores cerebrales

Resumen

Fuente: Yu, D. et al. Administración intranasal de células madre terapéuticas para el glioblastoma en un modelo de ratón. J. Vis. Exp.(2017)

Este video muestra la administración intranasal de células madre neurales terapéuticas cargadas de virus oncolíticos en un modelo de ratón portador de tumores cerebrales. La administración intranasal no invasiva de células madre evita la barrera hematoencefálica, lo que facilita su entrega al sitio del tumor en el cerebro para aplicaciones terapéuticas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Precondicionamiento hipóxico de las NSCs humanas (Figura 1A)

1. NSCs cultivadas en placa en matraces de cultivo T75 hasta alcanzar el 90% de confluencia.
2. Coloque los matraces de cultivo celular dentro de una cámara/incubadora de CO₂ humidificada con niveles de 1% de_O2 mantenidos durante 24 h, a través de un suministro de gas N₂ controlado por un medidor de flujo automatizado incorporado. Estas células se denominan NSC ^H. Las NSC ^Nde control se generan como:
   1. Mantener las NSC humanas (clones HB1.F3.CD) en medio DMEM con un 10% de FBS y un 1% de penicilina-estreptomicina en una incubadora humidificada a 37 °C con un 95% de aire ambiente y un 5% de CO₂.

>2. Carga de NSCs humanas con virus oncolíticos (Figura 1B-1H)

1. Infecte ^NNSCs, ^HNSCs con 50 partículas virales de adenovirus replicativo condicional (CRAd)-S-pk7/célula.
2. Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente con golpecitos periódicos, lavar las células tres veces con medios para eliminar las partículas virales no unidas y suspender las células en solución salina estéril para inyección><. cautela: Llevar a cabo todos los procedimientos de cultivo celular in vitro relacionados con virus en instalaciones con la designación de nivel de bioseguridad adecuada, como BSL2. Los investigadores que manipulan el virus oncolítico deben usar el equipo de protección personal adecuado según las pautas de los establecimientos institucionales de animales.

>3. Administración intranasal de NSCs terapéuticas (Figuras 1D y Figura 2D)

1. Cultivo y recolección de NSCs (^NNSCs, ^HNSCs).
2. Anestesiar ratones mediante inyección i.p. de una mezcla de ketamina y xilacina de acuerdo con el procedimiento:
   1. Anestesiar al animal en función del peso corporal utilizando los reactivos aprobados, es decir, mediante una inyección intraperitoneal (i.p.) de una mezcla de ketamina (50-100 mg/kg; consulte a la IACUC institucional para conocer el rango de dosis aprobado) y xilacina (5-10 mg/kg; consulte a la IACUC institucional para conocer el rango de dosis aprobado) en solución salina estéril de 200-250 μL, o mediante anestesia con isoflurano al 4-5% con un dispositivo inhalatorio.
3. Coloque los ratones en una cortina limpia boca arriba con una almohadilla térmica debajo para mantener la temperatura corporal. Ajuste una almohada acolchada hecha de toallas de papel enrolladas con cintas adhesivas para asegurar el ángulo vertical de las fosas nasales cuando se coloque debajo de la cabeza del ratón.
4. Con una micropipeta, dispense 2 μL de suspensión de NSC en cada fosa nasal del ratón. Confirme visualmente la aspiración de la gota antes de pasar al siguiente ratón. El número total de celdas entregadas puede ser determinado por el usuario; utilizar entre 62.500 y 125.000 células/μL, de modo que se puedan administrar entre 0,5 y 1 millón de células en dosis de 4 x 2 μL.
5. Utilice un temporizador para asegurar intervalos de 5 minutos entre cada administración de suspensión celular, hasta 4 veces.
6. Permita que los animales recuperen la movilidad en una cámara de recuperación, manteniendo la posición supina en todo momento.

Resultados

Figura 1: Diagrama de flujo de los procedimientos generales de preparación de células madre antes de la administración intranasal. (De la A a la C) Pretratamiento hipóxico o modificaciones genéticas de células madre para sobreexpresar CXCR4. (B-D) Se realizan pasos de lavado, disociación enzimática, recolección de células y recuento para la carga posterior de células...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suministros para cultivos celulares (plásticos)	ThermoFisher Scientific	Varía	Reemplazable con cualquier fuente
Microcentrífuga refrigerada Legend Micro 21R	ThermoFisher Scientific	75002490	Reemplazable con cualquier fuente
Centrífuga de sobremesa Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Reemplazable con cualquier fuente