Generación de microtumores: una técnica de cultivo in vitro para cultivar microtumores en 3D y analizar la respuesta al tratamiento farmacológico

Resumen

Fuente: Gilbert, A. N. et al. Generación de microtumores utilizando un sistema de cultivo de biogel humano en 3D y células de glioblastoma derivadas de pacientes para la elaboración de perfiles cinómicos y pruebas de respuesta a fármacos. J. Vis. Exp. (2016)

En este video, generamos microtumores a partir de células tumorales derivadas de pacientes utilizando biogel humano 3D. Estos microtumores se asemejan mucho al microambiente tumoral in vivo y sirven como plataformas potenciales para la prueba de fármacos.

Protocolo

1. Generación de microtumores

1. Preparación de reactivos
   1. Prepare NBM completo agregando lo siguiente a una botella de 500 mL de Neurobasal Media (NBM) para preparar NBM completo: 10 mL de suplemento de B-27 sin vitamina A, 5 mL de suplemento de N2, 100 μL de EGF, 100 μL de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)-Básico, 5 mL de anfotericina B, 0,5 mL de gentamicina, 5 mL de L-glutamina y prepare biogel humano de alta densidad neutralizado (HuBiogel) (HDHG a 3 mg/mL) según protocolo interno. También se pueden utilizar matrices de biogel similares.
2. Producción y cultivo de microtumores
   1. Obtenga células PDX recién disociadas como suspensión de una sola célula en NBM completo, en hielo.
   2. Mezcle la suspensión celular con un volumen igual de solución de azul de tripán (0.4% en PBS) y analice usando hemocitómetro para determinar el número de células y la viabilidad por exclusión de azul de tripano. Extraer el volumen necesario para generar 50.000 células/microtumor donde volumen = (50.000 células/tumor * # tumores)/(recuento de células viables / 1 mL) y colocar en un tubo cónico nuevo.
   3. Células concentradas por centrifugación a 150 x g, durante 8 min, a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda con una solución helada de HDHG en una proporción final de 1 parte de células en FBS y 4 partes de HDHG.
   4. Utilice una pipeta electrónica multicanal para dispensar 10 μL por pin de mezcla de células y HDHG en una placa de acero de 96 pines (con recubrimiento hidrofóbico) para generar microtumores (perlas de 2 mm que contienen 50.000 células cada una).
   5. Coloque las perlas tumorales 3D dentro de la incubadora de cultivo de tejidos (37 °C, 5% de CO₂, humidificada) durante 15 minutos para gelificar las perlas.
   6. Después de la gelificación, transfiera los microtumores (10 μL) a una cámara de cultivo en suspensión personalizada (50 mL) o a una placa de cultivo de gran volumen (10 cm) que contenga NBM completo utilizando la pipeta electrónica multicanal y el dispositivo de clavija personalizado.
   7. Después de 1 a 2 días en la incubadora de cultivo de tejidos, transfiera los microtumores a placas de cultivo de 96 pocillos que contengan 50 μL de NBM/pocillo utilizando una pipeta dispensadora de boca ancha y realice varios protocolos de ensayo y análisis.
3. Tratamiento farmacológico y mantenimiento de microtumores
   1. Seleccione las concentraciones finales para las pruebas de drogas.
      NOTA: Si el fármaco tiene eficacia conocida en cultivo 2D, seleccione 2 veces la IC50 como concentración de dosis media y seleccione diluciones seriadas de 3 veces por encima y por debajo para un total de 5 niveles de dosis. Por ejemplo, si el IC50 es de 9 μM para el fármaco en cultivo 2D, seleccione 2 μM, 6 μM, 18 μM, 54 μM y 162 μM como concentración final para las pruebas de fármaco.
   2. Prepare 2 soluciones de dosificación de fármacos en NBM completo a partir de caldo de dimetilsulfóxido (DMSO). Diluya la solución dosificadora en medio DMSO al 1% para preparar una dilución en serie de 5 dosis y 3 veces.
   3. Añadir 50 μL de solución dosificadora al pocillo microtumoral que contenga 50 μL en placas de ensayo para lograr una concentración final de DMSO del 0,5%. Repita para cada réplica (p. ej., 4) en cada dosis de fármaco determinada en el paso 1.3.1.
   4. Mantenga los cultivos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados a 37 °C, 5 % de CO₂, durante 1 a 14 días. Alimente los cultivos dos veces por semana mediante medios refrescantes y solución de medicamentos como se indicó anteriormente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Colagenasa-I	Sigma-Aldrich	CO130
Neurobasal-A	Tecnologías de la Vida	10888-022
Suplemento N-2	Tecnologías de la Vida	17502-048	1x concentración final
Suplemento de B-27 sin vitamina A	Tecnologías de la Vida	12587-010	1x concentración final
FGF humano recombinante-básico	Tecnologías de la Vida	PHG0266	Concentración final de 10 ng/mL
L-Glutamina	Corning Cellgro Mediatech	25-005-CI	Concentración final de 2 mM
gentamicina	Tecnologías de la Vida	15750-060	Concentración final de 50 ng/mL
Azul de tripano	Perforar ThermoScientific	15250-061
Hubiogel de alta densidad	Vivo Biosciences	HDHG-5
Dmso	pescador	BP231	Para la disolución de la calceína AM y los compuestos
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con Ca/Mg	Corning Cellgro Mediatech	20-030-CV	Diluido a 1x con agua ultrapura MiliQ (para el lavado previo a la fijación)
10% de formalina tamponada neutra	protocolo	032-060
Placas de Petri de vidrio de 100 mm	pescador	08-748D