Inducción de glioblastoma mediante transposición mediada por SB: una técnica para generar un nuevo modelo de ratón mediante la integración mediada por transposones de plásmido SB en el cerebro de ratón neonatal

Resumen

Fuente: Calinescu, A. A. et al. Integración mediada por transposones de ADN plasmídico en la zona subventricular de ratones neonatos para generar nuevos modelos de glioblastoma. J. Vis. Exp. (2015)

Este video describe una técnica eficiente para inducir glioblastomas (GBM) utilizando ADN transposónico inyectado en los ventrículos de ratones neonatos. Las células de la zona subventricular, que absorben el plásmido, se transforman, proliferan y generan tumores con características histopatológicas de la MBG humana.

Protocolo

1. Inyecciones intraventriculares neonatales

1. Tres o cuatro semanas antes del experimento, instale una jaula de cría de ratones con un ratón macho y una hembra, y un iglú de color plástico. Esto proporciona un entorno enriquecido y ayuda en el proceso de apareamiento.
2. Cuando se confirme el embarazo, retire al macho a una nueva jaula. Dieciocho días después del apareamiento, monitoree la jaula diariamente para el parto. Realizar inyecciones intraventriculares en el día postnatal 1(P1).
3. Preparación de la solución inyectable.
   NOTA: La solución inyectable se realiza mezclando el ADN plasmídico con el reactivo de transfección para crear las partículas para la transfección. A continuación se muestra un ejemplo de la preparación de una solución inyectable utilizando un plásmido que codifica la transposasa y la luciferasa de la Bella Durmiente: pT2/SB100x-Luc y dos plásmidos transposónicos: pT/CAGGS-NRASV12 y pT/CMV-SV40-LgT, en una proporción de 1:2:2. Todos los plásmidos tienen una concentración de 2 μg/μL.
   1. Prepare la solución de ADN añadiendo: 4 μg (2 μL) de pT2/SB100x-Luc, 8 μg (4 μL) de pT/CAGGS-NRASV12 y 8 μg (4 μL) de pT/CMV-SV40-LgT y 10 μL de glucosa al 10% hasta un volumen final de 20 μL a una concentración de 1 μg/mL de ADN y 5% de glucosa.
   2. Prepare la solución de PEI añadiendo 2,8 μL de PEI jet in vivo, 7,2 μL de agua estéril y 10 μL de glucosa al 10% hasta una concentración final de glucosa al 5%.
   3. Agregue la solución de PEI a la solución de ADN, mezcle y haga vórtice y deje reposar a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos. La solución ya está lista para la inyección. Después de una hora en RT, mantenga la solución en hielo.
   4. Coloque una jeringa limpia de 10 μL equipada con una aguja hipodérmica de 30G con bisel de 12,5° en la microbomba (Figura 1 #1).
4. Para verificar el correcto funcionamiento del sistema de inyección, use el inyector automático (Figura 1 #1) para extraer 10 μL de agua en la jeringa y luego vacíe la jeringa por completo.
5. Enfríe la etapa estereotáxica neonatal (Figura 1 #3) con una mezcla de hielo seco y alcohol a una temperatura de 2 a 8 °C.
6. Inducir la anestesia colocando a los cachorros en hielo húmedo durante 2 min. La anestesia continuará en el marco estereotáxico enfriado durante el resto del procedimiento. Mantener la temperatura del marco por encima del punto de congelación, entre 2 y 8 °C, evitará lesiones por quemaduras térmicas. Como precaución especial, los cachorros se pueden envolver en gasa antes de colocarlos en hielo húmedo.
7. Llene la jeringa con la solución de ADN/PEI.
8. Inmovilice al cachorro en el marco estereotáxico colocando su cabeza entre las barras de las orejas cubiertas de gasa (Figura 1b). Asegúrese de que la cara dorsal del cráneo esté horizontal, paralela a la superficie del marco y que las suturas craneales sean claramente visibles. Limpie la cabeza con etanol al 70%.
9. Baje la aguja de la jeringa y ajuste las coordenadas estereotáxicas utilizando los diales del marco estereotáxico hasta que la aguja toque la lambda (la intersección de la línea media de los huesos parietal y occipital) (Figura 1b).
10. Levante la aguja y ajuste las coordenadas estereotáxicas a 0,8 mm lateral y 1,5 mm rostral a la lambda (Figura 1b).
11. Baje la aguja hasta que toque y haga hoyuelos leves en la piel. Mide las coordenadas. Baje la aguja otros 1,5 mm. La aguja perforará la piel y el cráneo, y atravesará la corteza para entrar en el ventrículo lateral (Figura 1c).
12. Con el inyector automático, inyecte 0,75 μL de la solución de ADN/PEI a una velocidad de 0,5 μL/min.
13. Mantenga al cachorro en el marco durante un minuto más para permitir que la solución se disperse en los ventrículos. Mientras tanto, anestesia a otro cachorro, en hielo durante 2 minutos en preparación para la próxima inyección.
14. Levante suave y lentamente la aguja y coloque al cachorro debajo de una lámpara de calentamiento. Controle la respiración y la actividad. Si es necesario, estimule suavemente las extremidades hasta que se produzca la primera respiración.
15. Devuelva el cachorro a su madre después de que se haya calentado, haya alcanzado un color rosado, respire con regularidad y esté activo, normalmente de 5 a 7 minutos. Si se inyecta más de una cría a la vez, mantenga a todas las crías juntas hasta que se hayan realizado todas las inyecciones. Si las inyecciones duran más de 30 minutos, devuelva la mitad de las crías después de los primeros 30 minutos y el resto al final del procedimiento.
16. Supervise que la madre responda y cuide a sus cachorros. Si es necesario, agregue una madre sustituta a la jaula.
17. Asegúrese de que el intervalo entre colocar al cachorro en hielo y colocarlo debajo de la lámpara de calentamiento sea inferior a 10 minutos. Cuanto más rápido sea el procedimiento, mejor será la supervivencia. Por lo general, el tiempo que se tarda en anestesiar e inyectar a un cachorro es de 4 minutos.

Resultados

Figura 1: Configuración experimental y guías para inyecciones intraventriculares en ratones neonatos. (a)Un marco estereotáxico (2) con diales micrométricos está equipado con un inyector automático que sostiene una jeringa de 10 μl (4). Dentro del marco en U, se sujeta firmemente un marco adaptador neonatal (3). El panel de control del inyector automático (1) permite una selección pr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Estándar de laboratorio de Stoelting con adaptadores para ratas y ratones	Guardando	51670	Otras empresas producen marcos similares, cualquiera de ellos con pequeños adaptadores de ratón son adecuados
Inyector estereotáxico por excelencia (QSI)	Guardando	53311	Las inyecciones se pueden realizar sin él, pero el inyector automático permite una mayor reproducibilidad y comodidad
Jeringa manual MICROLITER de la serie 700 de 10 μL	Hamilton	Modelo 701	Este modelo de jeringa suministrará de 0,5 a 500 μL de solución de forma fiable. También se pueden utilizar otras jeringas (por ejemplo, 5 μL, modelo 75)
Aguja hipodérmica de calibre 30 (bisel de 1,25", 15^{o})	Hamilton	S/O# 197462	Esta aguja es ideal para perforar la piel y el cráneo de un ratón neonatal sin necesidad de otros procedimientos invasivos. Si se vuelve opaco (no entra fácilmente en la piel), debe ser reemplazado.
Jet PEI in vivo	Transfección Polyplus	201-10G	Alícuota en pequeños volúmenes y mantener a -20ºC
D-Luciferina, Sal de Potasio	Goldbio.com	SuerteK-1g	Otras fuentes de lucifirerasa de luciérnaga son igual de adecuadas
Solución de hematoxilina, modificada por Harris	Sigma Aldrich	HHS128-4L