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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Disección
NOTA: No se requieren condiciones estériles a menos que se utilicen recipientes para fines de cultivo celular. Prepare las soluciones de los recipientes de aislamiento: B1, agregue 1,5 mL de HEPES 1M a 150 mL de HBSS; B2, añadir 3,6 g de Dextrano a 20 mL de B1; B3, añadir 1 g de BSA a 100 mL de B1.
- Prepare un vaso de precipitados de 150 mL con 20 mL de B1. Manténgalo en hielo y cúbralo con parafilm para evitar la contaminación del aire.
- Anestesia profundamente al ratón bajo una capucha con una pequeña toalla de papel empapada en 1 ml de isoflurano puro que se agrega a la jaula. La anestesia se verifica por la falta de reacción a un pellizco en el dedo del pie. Mata al ratón por luxación cervical.
nota: Estos pasos se llevan a cabo en cumplimiento de la normativa nacional e institucional.
- Opcional: Realizar perfusión intracardíaca con 20 mL de PBS 1x para eliminar el contenido sanguíneo.
- Secciona la piel con un bisturí desde el cuello hasta la nariz y tira de ella. Elimine todos los pelos contaminantes con PBS 1x.
- Para abrir el cráneo, primero, inserte las tijeras anteriormente en el bulbo olfatorio y abra las tijeras para romper el cráneo en dos partes.
- Retire con cuidado el cerebro con una espátula para cerebro. Diseccionar el plexo coroideo de los ventrículos laterales, ya que contaminarían la preparación >nota: Opcional: La preparación final contendrá vasos parenquimatoso y meninges. Si no se desea, las meninges se pueden despegar.
- Transfiera el cerebro al vaso de precipitados que contiene solución B1 en hielo. Se pueden tratar hasta 8 cerebros juntos.
>2. Homogeneización del tejido cerebral
- Utilizando dos bisturíes, se batió manual y enérgicamente el cerebro en la solución B1 obteniendo posteriormente pequeños trozos de unos 2 mm.
- Homogeneiza la preparación con un homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 golpes a 400 rpm. Asegúrese de que el tubo de vidrio se mantenga en hielo y que la parte superior del taponador esté en solución al moverse hacia arriba y hacia abajo, para evitar la formación de bolsas de aire. Si se preparan varias muestras, lavar el dosificador con agua ionizada entre cada homogeneización.
3. Purificación de recipientes
- Transfiera el homogeneizado a un tubo de plástico de 50 mL y proceda a la centrifugación a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C. Se formará una gran interfase blanca (principalmente mielina) en la parte superior del gránulo del vaso (rojo si no se realizó perfusión).
- Deseche el sobrenadante. El pellet del recipiente y la interfaz blanca permanecerán unidos. Añadir 20 ml de solución B2 helada y agitar el tubo manual y enérgicamente durante 1 min.
- Proceda a la segunda centrifugación a 4.400 x g durante 15 min a 4 °C. La mielina ahora formará una densa capa blanca en la superficie del sobrenadante.
- Separe con cuidado la capa de mielina de las paredes del tubo sosteniendo el tubo y girándolo lentamente para permitir que el sobrenadante pase a lo largo de las paredes. Deseche la mielina con el sobrenadante. El pellet que contiene los recipientes permanece unido en la parte inferior del tubo.
- Seque la pared interior del tubo con un papel absorbente envuelto alrededor de una pipeta de plástico de 5 ml y elimine todos los líquidos residuales, evite tocar el gránulo del recipiente. Mantenga el tubo boca abajo sobre un papel absorbente para drenar cualquier líquido restante.
- Suspenda el pellet en 1 mL de solución B3 helada pipeteando hacia arriba y hacia abajo con puntas de baja fijación, manteniendo el tubo en hielo, luego agregue otros 5 mL de solución B3. Asegúrese de que los recipientes estén dispersos tanto como sea posible y no formen agregados.
>4. Filtración
- Prepare un vaso de precipitados sobre hielo con 30 ml de solución B3 helada. Cubra con parafilm para evitar la contaminación del aire.
- Coloque un filtro de malla de 20 μm en un soporte de filtro modificado en la parte superior de un matraz Becker y equilibre aplicando 10 ml de solución B3 helada.
- Vierta la preparación del recipiente en el filtro y enjuague los recipientes con 40 ml de solución B3 helada.
- Recupere el filtro con pinzas limpias y sumérjalo inmediatamente en el vaso de precipitados que contiene la solución B3. Separe los recipientes del filtro agitándolo suavemente.
- Vierta el contenido del vaso de precipitados en un tubo de plástico de 50 ml y centrifugue a 2.000 x g durante 5 min a 4 °C.
nota: Alternativamente, la suspensión de los vasos cerebrales del paso 3.6 se puede filtrar en un filtro de malla de 100 μm. En este caso, los recipientes más grandes se retienen preferentemente en el filtro, mientras que el flujo contiene microvasos (principalmente capilares), que luego se filtran en un filtro de malla de 20 μm como se indicó anteriormente.
- Vuelva a suspender la pellets de microvasos en 1 mL de solución B3 helada y transfiera pipeteándola a un tubo Eppendorf de 1,5 mL. Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min a 4 °C.