Ensayo de fagocitosis in vitro: un método basado en imágenes en vivo para estudiar la fagocitosis sinaptosómica mediada por astrocitos en tiempo real

Resumen

Fuente: Byun, Y. G., Chung, W. S. Un novedoso ensayo de imagen en vivo in vitro de fagocitosis mediada por astrocitos utilizando sinaptosomas conjugados con indicadores de pH. J. Vis. Exp. (2018)

En este video, evaluamos la capacidad fagocítica de los astrocitos purificados in vitro mediante un ensayo de imagen en vivo. El ensayo sirve como una plataforma de cribado eficaz para identificar compuestos químicos que pueden mejorar o inhibir la capacidad fagocítica de los astrocitos.

Protocolo

1. Ensayo de imagen en vivo de fagocitosis (Figura 1)

1. Prepare una placa de 24 pocillos (o cualquier placa/plato que se prepare para imágenes en vivo) en la que los astrocitos confluyan (generalmente, 7 a 10 días de incubación después de la purificación es ideal para estabilizar las células).
2. Retire los medios de cada pocillo y lave los pocillos con 1 mL de solución salina tampón de fosfato (DPBS) de Dulbecco, tres veces. Para minimizar la exposición al aire, lave los pozos rápidamente.
3. Agregue 300 μL de medios básicos de astrocitos inmunopanificados (IP-ABM) con 5 μL de sinaptosomas conjugados con indicadores de pH y factores adicionales como medios condicionados por astrocitos inmunopanificados (IP-ACM) que pueden modular la fagocitosis de las células gliales.
4. Incubar la placa en una incubadora de CO₂ durante 40 min. Este paso permite que los sinaptosomas conjugados con indicadores de pH se asienten en el fondo de las placas.
5. Retire los medios con sinaptosomas conjugados con indicador de pH no unidos y lave cada pocillo con 1 mL de DPBS, tres veces.
   cautela: No se lave con fuerza. Para minimizar la exposición al aire, lave los pozos rápidamente.
6. Agregue 500 μL de IP-ABM con factores adicionales para probar en los pozos.
7. Lleve la placa a un instrumento de imágenes en vivo y seleccione las posiciones. Ajuste el enfoque, el tiempo de exposición, el brillo y la potencia del LED.
   nota: Los ajustes para el tiempo de exposición, el brillo y la potencia del LED varían según la intensidad de la fluorescencia y el propósito del experimento. En el ensayo de imagen en vivo con sinaptosomas conjugados con indicadores de pH, generalmente establecemos esos valores de la siguiente manera: exposición: ~ 150-200 ms, brillo: 15 y potencia del LED: 4-6.
8. Establezca el formato de imagen, el intervalo de tiempo y el número total de ciclos para las imágenes en vivo. Establezca el intervalo de tiempo en 1 o 2 h dependiendo de cuántas posiciones se seleccionen. Se recomiendan intervalos de 2 horas cuando se seleccionan más de 150 posiciones para la obtención de imágenes en vivo.
9. Inicie los experimentos de imágenes en vivo.

Resultados

Figura 1. Esquema del ensayo de imagen en vivo de fagocitosis.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Rojo pHrodo, éster de succinimidilo	Sondas de molecula	P36600	Para la conjugación de indicadores de pH
Suero fetal bovino (FBS)	Gibco	16000-044
DMEM	Gibco	11960-044
dPBS	Welgene	LB001-02
Ensayo de imagen en vivo de fagocitosis
Etapa Juli	NanoEntek
Complementos de Time Series Analyzer V3	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html