Electroporación ex vivo de rodajas cerebelosas de embriones de pollo: un método para introducir ADN plasmídico que codifica la proteína verde fluorescente para visualizar el desarrollo celular granular

Resumen

Fuente: Hanzel, M. et al.Cultivo ex vivo de rodajas cerebelosas de pollitos y electroporación espacialmente dirigida de precursores de células granulosas.J. Vis. Exp. (2015)

En este video, realizamos la electroporación de cortes de cerebelo de embrión de pollo con plásmidos de genes reporteros. La técnica facilita la visualización del desarrollo y la migración de los precursores de células granulares para formar una capa granular.

Protocolo

1. Electroporación de rodajas

1. Construya una cámara de electroporación fijando el ánodo de un electroporador a la base de una placa de Petri de 60 mm con cinta aislante. Agregue aproximadamente 1 mL de HBSS para cubrir el electrodo.
2. Coloque un inserto de cultivo de 0,4 μm encima del electrodo cubierto de HBSS. Deje que el inserto de cultivo descanse sobre el electrodo, asegurándose de que siempre haya contacto entre el inserto y el electrodo.
   nota: En esta configuración, el inserto de cultivo con las rodajas descansará sobre la superficie de la solución, manteniendo el circuito pero permitiendo la orientación espacial del cátodo.
3. Transfiera las rodajas identificadas (hasta cinco por inserto de cultivo) al inserto de cultivo con una pipeta Pasteur de 3 ml con la punta de corte. Separar y dejar reposar en el inserto de cultivo en orientación sagital.
4. Con una pipeta, retire el exceso de HBSS para que las rodajas ya no se bañen en la solución.
5. Con una punta de pipeta P10, pipetee el ADN (a una concentración de 1 μg/μL) diluido con un 20 % de verde rápido sobre la superficie de la región objetivo de un corte. El 20 % de verde rápido garantiza una solución de ADN viscosa y evita la dispersión prohibitiva del ADN. Agregue aproximadamente 5 μL de ADN/solución verde rápida a cada corte (Figura 1B).
6. Coloque el cátodo sobre el tejido objetivo deseado y electropore con 3 pulsos de 10 V y 10 mseg de duración. Evite el contacto directo del cátodo con el tejido. En su lugar, aproveche la tensión superficial del líquido para mantener la conductancia (coloque el cátodo lo más cerca posible del tejido sin tocar realmente el tejido).
7. Repita la entrega de ADN y la electroporación a múltiples regiones de EGL en cada corte cerebeloso individual según lo desee.
8. Una vez finalizada la electroporación, transfiera el inserto de cultivo a una placa de Petri de 30 mm.
9. A cada cultivo, agregue 1 mL de medio de cultivo precalentado (medio basal Eagle, 0,5% (p/v) de D-(+)-glucosa, suplemento de B27 al 1%, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina) debajo del inserto de cultivo de manera que el inserto de cultivo esté en contacto con el medio, pero las rodajas no se bañen en él.
10. Incubar cultivos a 37 °C/6% CO₂ durante un máximo de 3 días. Reemplace todo el medio de cultivo cada 24 horas con medio nuevo precalentado.
11. Después del cultivo, fije las rodajas en los insertos de cultivo durante 1 hora en paraformaldehído al 4% (o O/N a 4 °C) en un plato fresco de 30 mm sin medios de cultivo.

Resultados

Figura 1. Configuración de la cámara de electroporación. (A) Una imagen de la cámara de electroporación hecha a medida. La cámara consta de un ánodo de un electroporador colocado de forma segura en la base de una placa de Petri de 60 mm. La placa contiene aproximadamente 1 mL de HBSS para cubrir el electrodo. El inserto de cultivo debe descansar sobre el electrodo co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Águila mediana basal (Gibco)	Tecnologías de la Vida	41010-026
L-glutamina	sigma	G7513
Penicilina/Estreptomicina	sigma	P4333
Inserto de cultivo de 0,4 μm	Millipore	PICM0RG50
Electroporador TSS20 Ovodyne	Intracel	01-916-02	Utilice 3 pulsos de 10 V y 10 mseg para la electroporación.