Disección del cerebelo y preparación de cortes: un método para generar cortes de tejido a partir de cerebelo de ratón

Resumen

Fuente: Thetiot, M. et al. Preparación e inmunotinción de cultivos de cortes cerebelosos organotípicos mielinizantes. J. Vis. Exp. (2019)

Este video describe un método para generar cortes de tejido a partir del cerebelo del ratón. Las rodajas cerebelosas se pueden utilizar para el cultivo organotípico que proporciona información sobre los mecanismos del desarrollo neurológico, incluida la dinámica de la mielinización.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>1. Disección del cerebelo y preparación de secciones (tiempo de práctica ≈ 15-20 min por animal)

1. Coloque una de las placas de cultivo celular de 60 mm que contienen el medio de disección helado debajo del microscopio binocular y retire la placa superior.
2. Frote el pelaje de la cabeza con etanol al 70% (evitando cuidadosamente tocar los ojos del animal) y decapitar al animal con tijeras grandes y afiladas, de acuerdo con el procedimiento aprobado.
   NOTA: Las rebanadas cerebelosas se generan a partir de ratones P9-P10 sin ningún sesgo específico de sexo o cepa.
3. Use tijeras pequeñas para cortar la piel a lo largo de la línea media de la cabeza, comenzando desde el cuello y subiendo hasta el hocico del ratón.
4. Para sujetar la cabeza y exponer el cráneo, dobla la piel hacia atrás ventralmente debajo de la cabeza y pellizca los dos pliegues de piel entre los dedos.
5. Inserte las tijeras pequeñas suavemente en el foramen magnum y corte el cráneo haciendo una incisión lateral hacia el lado y luego corte todo el contorno del cráneo de la cabeza. Mantenga la punta de las tijeras lo más paralela y cerca posible del cráneo mientras corta, para evitar dañar el tejido cerebral.
6. Recupera la parte dorsal del cráneo con pinzas finas y rectas. Mientras levanta con cuidado la parte dorsal del cráneo, corte las meninges adheridas (membrana irrigada translúcida que rodea el tejido cerebral) si es necesario con unas tijeras pequeñas para evitar dañar el tejido cerebral.
7. Introduzca con cuidado unas pinzas finas y rectas (o alternativamente use una espátula) entre el cráneo ventral y el cerebro, voltee suavemente el cerebro y corte los nervios óptico y trigémino con unas tijeras pequeñas.
8. Ayude al cerebro a caer por gravedad en la placa de cultivo celular de 60 mm que contiene medio de disección helado girando la cabeza boca abajo justo encima de la placa y libere las últimas adherencias con tijeras pequeñas si es necesario.
9. Con pinzas finas, oriente el cerebro con el lado dorsal hacia el investigador y el lado ventral acostado en el fondo del plato.
10. Bajo el microscopio binocular, use las pinzas finas y rectas para inmovilizar el cerebro en el lado del prosencéfalo y evite tocar el cerebro posterior, ya que podría dañarse. Separe el cerebro posterior del resto del cerebro (prosencéfalo y mesencéfalo, ver esquema en la Figura 1Aa), usando pinzas finas y rectas. Para separar el cerebelo del resto del cerebro posterior, utilice las pinzas finas para cortar los pedúnculos cerebelosos por debajo del cerebelo (véase el esquema de la figura 1Aa').
11. Una vez aislado el cerebelo, se arrancan con cuidado las meninges con pinzas finas y rectas (véase el esquema de la figura 1Aa').
12. Sostenga el cerebelo suavemente con las pinzas curvas finas y colóquelo con el lado dorsal hacia arriba sobre la plataforma de plástico perpendicularmente a la hoja de afeitar picadora (consulte el esquema en la Figura 1Bb).
13. Aspire cualquier exceso de medio de disección alrededor del cerebelo utilizando una punta de pipeta estéril de extremo fino adaptada a una pipeta de 1 mL (véase el esquema de la figura 1Bb).
14. Asegúrese de que el cerebelo quede plano, pero no estirado, una vez colocado en la plataforma para obtener cortes sagitales óptimos durante el corte (ver esquema en la Figura 1Bb).
15. Cortar secciones sagitales de 300 μm de espesor del cerebelo con el picador de tejidos (véase el esquema de la figura 1Bb'). La fuerza y la velocidad de la cuchilla deben optimizarse in situ.
16. Agregue suavemente una gota de medio de disección sobre el cerebelo en rodajas. Utilizando una punta de pipeta de diámetro ancho colocada sobre una pipeta de 1 mL, aspire lentamente el cerebelo cortado y transfiéralo de nuevo a la placa de cultivo celular de 60 mm que contiene el medio de disección helado (véase el esquema de la figura 1Bb'').
17. Limpie la plataforma de plástico de la picadora de pañuelos con etanol al 100% entre cada corte del cerebelo. Deje que el etanol se evapore antes de colocar el siguiente cerebelo en la plataforma.
18. Utilice dos pinzas rectas finas (o alternativamente agujas de titanio) para separar las rodajas individuales y seleccione de 6 a 8 rodajas del vermis (ver esquema en la figura 1Cc y 1Cc').
19. Tome una placa de 6 pocillos con insertos de cultivo y transfiera hasta 4 cortes seleccionados a un inserto de cultivo junto con algún medio de disección, utilizando una punta de pipeta de diámetro ancho adaptada a una pipeta de 1 mL (ver esquema en la Figura 1Cc').
20. Coloque las rodajas en el centro del inserto de cultivo utilizando el medio de disección o las pinzas para empujarlas y tirar suavemente hacia el lugar correcto, evitando que estén en contacto entre sí (ver esquema en la Figura 1Cc').
21. Retire cualquier exceso de medio de disección alrededor de las rodajas con una punta de pipeta de extremo fino. Asegúrese de que las rodajas queden planas sobre la membrana (véase el esquema de la figura 1Cc').
22. Coloque la placa de 6 pocillos en la incubadora inmediatamente después de haber agregado las rodajas en la membrana.

Resultados

Figura 1: Ilustración de la generación de rodajas de cerebelo. La disección se divide en tres pasos principales. (A) Se aísla el cerebelo y se extirpan las meninges (pasos 1.10 y 1.11). (B) A continuación, el cerebelo se transfiere a la plataforma picadora y se corta en rodajas (pasos 1.12 a 1.16). (C) Por último, las rodajas se aísl...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio BME	ThermoFisher Scientific	41010026
Solución salina equilibrada de Hank (10x HBSS)	ThermoFisher Scientific	14180046
GlutaMAX (100x)	ThermoFisher Scientific	35050038
Suero de caballo inactivado por calor	ThermoFisher Scientific	26050088
Penicilina-estreptomicina (10.000 UI/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
Solución salina equilibrada de Gey	Sigma Aldrich	G9779-500ML
Solución de D-glucosa (45%)	Sigma Aldrich	G8769-100ML
Paraformaldehído (PFA)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	Año 15714
Etanol absoluto (100% etanol)	Productos químicos de VWR	20821.33
Tritón® X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML	Refrigerado a -20 °C
10% Suero de Cabra Normal (NGS)	ThermoFisher Scientific	500622
Solución tampón de fosfato	EuroMEDEX	ET330-A
Picadora de pañuelos	McIlwain		pH 7.4
Afeitar
Tijeras grandes	F.S.T	14101-14
Tijeras pequeñas	F.S.T	91500-09
Pinzas finas-rectas	F.S.T	91150-20
Pinzas curvas finas	F.S.T	11297-00
Placas de cultivo celular (60 mm y 100 mm)	TPP
Placas de cultivo de 4 y 6 pocillos	TPP
Insertos de cultivo de milicélulas (0,4 μm, 30 mm de diámetro)	Merck Millipore	PICM0RG50
Incubadora de cultivos celulares
Puntas de pipeta de extremo fino	Dutscher	134000CL	37°C, 5% CO2
Puntas de pipeta de diámetro ancho	ThermoFisher Scientific	2079G
Jeringa estéril	Terumo Europa
Filtros de jeringa estériles	Terumo Europa		20 o 50 mL
escalpelo	Swann-Morton	510	0,22 μm
cepillo
Portaobjetos de microscopio	RS Francia
Cubreobjetos de vidrio	RS Francia		76 mm x 26 mm x 1,1 mm
Limpiadores de tejidos Kimtech Sciences	Kimberly-Clark Profesional	5511	22 mm x 22 mm
Microscopio binocular