Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de la cultura en rodajas
- Prepare cultivos organotípicos de cortes de hipocampo de ratón utilizando ratones postnatales de 6 a 7 días de edad de ambos sexos.
- Preparar medios de disección para el cultivo organotípico de cortes que consisten en (en mM): 238 sacarosa, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 y 11 glucosa en agua desionizada, luego gas con 5% de CO2/95% O2 a un pH de 7,4.
- Prepare medios de cultivo organotípicos en rodajas que consistan en: 78,8% (v/v) de Medio Esencial Mínimo Eagle, 20% (v/v) de suero de caballo, 17,9 mM de NaHCO3, 26,6 mM de glucosa, 2 M de CaCl2, 2 M de MgSO4, 30 mM de HEPES, insulina (1 μg/mL) y 0,06 mM de ácido ascórbico, pH ajustado a 7,3. Ajuste la osmolaridad a 310-330 osmol con un osmómetro.
- Diseccione el hipocampo de todo el cerebro con dos espátulas y corte (400 μm) con un picador de tejido. Separe las rodajas con dos pinzas y transfiéralas a insertos de cultivo celular de 30 mm en una placa de 6 pocillos llena de medios de cultivo (950 μL) debajo de los insertos.
- Almacene los cultivos organotípicos de cortes en una incubadora de cultivos de tejidos (35 °C, 5% de CO2) y cambie los medios de cultivo de cortes cada dos días.
>2. Preparación de plásmidos
- Prepare el plásmido para el gen de interés.
- Subclona el gen de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) en un vector pCAV.
- Purifique el plásmido pCAG-EGFP con un kit de purificación libre de endotoxinas y disuélvalo en una solución interna que consista en agua tratada con pirocarbonato de dietilo que contenga 140 mM de K-metanosulfonato, 0,2 mM de EGTA, 2 mM de MgCl2 y 10 mM de HEPES, ajustado a pH 7,3 con KOH (concentración de plásmido: 0,1 μg/μL).
>3. Preparación de pipetas de vidrio
- Tire de pipetas de vidrio de borosilicato (4,5–8 MΩ) en un extractor de micropipetas (Figura 1A).
nota: Las pipetas de vidrio utilizadas para las grabaciones de patches de celda completa son ideales para la electroporación.
- Hornee las pipetas de vidrio durante la noche a 200 °C para esterilizar.
- Compruebe el tamaño de la punta de la pipeta bajo un microscopio de disección para aproximar la resistencia eléctrica.
- Opcional: Verifique la resistencia de la pipeta conectándola al electrodo de electroporación y utilice el micromanipulador para maniobrar la punta de la pipeta en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) esterilizado por filtro que contenga (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 y 11 glucosa en agua desionizada, gaseada con 5% CO2/95% O2a un pH de 7,4. Confirme la resistencia real utilizando la lectura en el electroporador.
nota: Cuanto más afilada sea la punta de la pipeta, mayor será la resistencia eléctrica. La resistencia de la pipeta debe ser inferior a 10 MΩ. Las pipetas de vidrio con alta resistencia a la pipeta (Figura 1B) a menudo se obstruyen en la punta durante la electroporación repetida.
>4. Configuración de la plataforma de electroporación
- Instale el electroporador en un equipo de electrofisiología de celda completa estándar, equipado con un microscopio vertical montado en una mesa móvil con un micromanipulador y una bomba peristáltica.
- Instale la cabecera del electroporador en un micromanipulador y conecte un par de altavoces al electroporador. Conecte el electroporador a un pedal que se puede usar para enviar un pulso cuando esté listo.
nota: Los altavoces emiten un tono cuando se encienden, que es un indicador de la resistencia eléctrica en el electrodo. Esto permite determinar los cambios relativos en la resistencia sin desviar la atención del procedimiento.
>5. Preparación de la electroporación
- Transfiera los insertos de cultivo en rodajas de placas de 6 pocillos a placas de Petri de 3 cm cargadas con 900 μL de medios de cultivo y almacene en una incubadora de CO2 de mesa hasta que esté listo para realizar la electroporación.
- Preincube los insertos de cultivo fresco con medios de cultivo en rodajas (1 ml) durante al menos 30 minutos en una placa de Petri de 3,5 cm para cultivar rodajas después de la electroporación.
- Limpie y prepare el equipo para la electroporación.
- Perfunda las líneas con lejía al 10% durante 5 minutos para esterilizar el tubo y la cámara antes de comenzar el experimento del día.
- Perfunda las líneas con agua desionizada esterilizada en autoclave durante al menos 30 minutos para enjuagar completamente.
- Perfundir las líneas con aCSF esterilizado por filtro que contenga 0,001 mM de tetrodotoxina (TTX).
nota: TTX minimiza la toxicidad celular y la muerte debido a la sobreexcitación de las interneuronas.
- Ajuste los parámetros de pulso del electroporador: amplitud de –5 V, pulso cuadrado, tren de 500 ms, frecuencia de 50 Hz y un ancho de pulso de 500 μs.
- Llene la pipeta de vidrio con 5 μL de solución interna que contiene plásmidos.
- Elimine las burbujas de aire atrapadas en la punta de la pipeta moviendo y golpeando suavemente la punta varias veces.
- Compruebe si la punta está dañada visualizándola bajo un microscopio de disección o repitiendo el paso 3.3.1 para comprobar la resistencia de la pipeta.
nota: Si la punta está dañada, se debe desechar la pipeta de vidrio y se debe repetir este paso con una nueva pipeta de vidrio preparada previamente en el paso 3.
- Fije de forma segura la punta de la pipeta al electrodo y encienda los altavoces. Registre la lectura (la resistencia de la pipeta) del electroporador cuando la punta haya entrado en contacto con el medio aCSF.
- Corte la membrana del inserto de cultivo con una cuchilla afilada y aísle un cultivo en rodajas. Transfiera con cuidado el cultivo en rodajas a la cámara de electroporación utilizando pinzas en ángulo afilado y fije su posición con un anclaje de corte.
- No mantenga el cultivo de rebanadas fuera de la incubadora durante más de 30 minutos seguidos para evitar efectos secundarios como cambios en la salud o la función neuronal.
>6. Células electroporadas de interés
- Aplique presión positiva a la pipeta con la boca o utilizando una jeringa de 1 ml (0,2-0,5 ml de presión) conectada al tubo.
- Utilice los controles de perilla tridimensional del micromanipulador para maniobrar la punta de la pipeta cerca de la superficie del cultivo de rebanadas.
- Elija una célula objetivo y acérquese a ella, manteniendo la presión positiva aplicada hasta que se forme un hoyuelo en la superficie de la célula, visible en el microscopio.
- Realizar ciclos de presión.
- Aplique rápidamente una presión negativa leve por vía oral para que se forme un sello suelto entre la punta de la pipeta y la membrana plasmática, indicado visualmente por la membrana que sube un poco hacia la punta de la pipeta. Observe un aumento (~2,5 veces la resistencia inicial) en la resistencia de la pipeta escuchando un aumento en el tono proveniente de los altavoces. Vuelva a aplicar rápidamente la presión positiva para que el hoyuelo se vuelva a formar.
- Complete inmediatamente al menos dos ciclos de presión más sin pausa, luego mantenga la presión negativa durante 1 s.
nota: Hacer una pausa entre ciclos, aplicar demasiada presión o mantener la presión negativa durante demasiado tiempo puede causar un daño significativo a la célula y posiblemente hacer que la célula muera durante la electroporación.
- Pulse rápidamente el electroporador una vez que use el pedal cuando el tono de los altavoces alcance un ápice estable en el tono, lo que indica una resistencia eléctrica máxima. No espere en la resistencia máxima durante más de 1 s antes de enviar el pulso.
nota: No hemos observado electroporación fuera del objetivo cuando se utiliza este protocolo. Solo se transfectaron las células en contacto con la pipeta de vidrio durante los ciclos de presión. Colocar la pipeta cerca de otras neuronas no da lugar a la transfección de genes.
- Retraiga suavemente la pipeta a unos 100 μm de la célula sin aplicar presión.
- Vuelva a aplicar presión positiva, verificando que la resistencia sea similar a la lectura registrada en el paso 5.5, luego acérquese a la siguiente celda.
- Elimine las posibles obstrucciones, indicadas visualmente o por una resistencia de pipeta significativamente aumentada (>15% mayor) después de la electroporación, mediante la aplicación de presión positiva.
nota: Si no hay ninguna obstrucción visible y la resistencia sigue siendo significativamente mayor, deseche la pipeta y utilice una nueva. Por término medio, una pipeta puede utilizarse para un máximo de 20 eventos de electroporación si el usuario tiene cuidado.
Después de la electroporación, transfiera el cultivo en rodajas a un inserto de cultivo fresco e incube a 35 °C en la incubadora durante un máximo de 3 días.
