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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Recolección de médula espinal
NOTA: Todos los instrumentos deben ser esterilizados en autoclave (135 °C y 30 psi durante ciclos de 4 x 7 min) para mayor esterilidad.
- Eutanasia de crías de ratón C57BL/6 de 1 a 3 días de edad en una cámara con isoflurano. Espere 30 segundos después del cese del movimiento y pellizque la pierna para confirmar la falta de respuesta.
- Separe la cabeza del cuerpo con unas tijeras, con el cachorro en posición prona.
- Estabilice las patas traseras o la cola y los brazos en la mesa de procedimientos, con el lado dorsal hacia el usuario.
- Corta la piel con unas tijeras de iris curvas.
- Corte la médula espinal de la región lumbar justo por encima de las caderas y proceda a cortar ambos lados del tórax para separarlo del cuerpo><.
nota: Esto requiere la disección cuidadosa de la médula espinal de los órganos viscerales para evitar daños inadvertidos a otros órganos (Figura 1a).
- Lavar secuencialmente durante 10 s en placas de Petri de 3 x 10 cm que contienen 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) esterilizada con filtro de 0,2 μm para eliminar el exceso de tejido.
- Inserte una aguja de 22G y una jeringa llena con 5 mL de PBS esterilizado con filtro en el extremo caudal de la columna vertebral y enjuague cranealmente, permitiendo que el cordón salga a una cuarta placa de Petri (Figura 1b).
- Recoja la médula espinal en un tubo de 15 mL con 5 mL de HABG (Tabla 1) en hielo. Tenga cuidado para evitar aplastar la médula espinal.
- Repita los pasos 1.1 a 1.8 para cada cachorro de la camada.
nota: Idealmente, este proceso debería tomar menos de 30 minutos por médula espinal para garantizar un aislamiento saludable de las neuronas.
>2. Aislar neuronas
NOTA: El siguiente paso debe realizarse en una campana de flujo laminar. Se espera estar familiarizado con la técnica estéril básica.
- Picado de tejidos
- Tome el tubo que contiene la médula espinal y agite ligeramente para suspender el tejido.
- Vierta el pañuelo del tubo en una placa de Petri de vidrio de 60 mm y córtelo en dados con una cuchilla de afeitar para crear piezas finas de ~0,5 mm de tamaño.
- Transfiera el tejido con una pipeta de diámetro ancho a un tubo de 15 mL que contenga 5 mL de HABG.
- Colóquelo en un baño de agua a 30 °C durante 30 minutos para permitir que las células se equilibren a esta temperatura. Mantenga las células en un agitador lo suficiente para permitir que se suspendan en el líquido.
nota: Este paso se realiza para evitar el choque de las células al transferirlas del hielo al medio de digestión. Mantener las células a 30 °C ayuda a disminuir la muerte celular asociada con un metabolismo aumentado a 37 °C.
- Preparar el medio de digestión (Tabla 1).
- Preparar el gradiente de densidad (Tabla 1).
- Prepare cada una de las 4 capas en 4 tubos separados de 15 mL, como se describe en la Tabla 1.
- Agregue 1 mL de cada capa en un nuevo tubo de 15 mL. Comience con la capa 1 en la parte inferior y agregue secuencialmente hasta llegar a la capa 4 en la parte superior. Evite alterar las capas mientras agrega.
- Lave las placas recubiertas de PDL. Lavar con agua estéril durante unos minutos antes de eliminar el agua restante y dejar que se sequen durante 1 hora.
- Transfiera el tejido al medio de digestión.
- Retire el tubo de papel higiénico del baño de agua de la coctelera a 30 °C y deje que se asiente durante unos minutos.
- Retire el tubo de medio de digestión del baño de agua a 37 °C y aspire en una jeringa leur-lock.
- Aspire el exceso de HABG del tubo que contiene tejido.
- Utilice un filtro leur-lock de 0,2 μm en la jeringa para añadir medio de digestión al tubo que contiene tejido.
- Coloque el tubo en un baño de agua a 30 °C durante 30 min. Mantenga las células temblando lo suficiente para permitir que queden suspendidas en el líquido.
nota: Es importante no mantener las células en el medio de digestión durante demasiado tiempo o dejar que la temperatura suba demasiado, lo que podría provocar una digestión excesiva y hacer que el tejido quede suspendido en una mezcla gelatinosa.
- Durante este período, cubra la laminina.
- Realizar la trituración (es decir, separar las células del tejido).
- Retire el tubo del baño de agua agitado a 30 °C y deje que se asiente durante unos minutos.
- Aspirar el exceso de medio de digestión.
- Suspenda el tejido en 2 mL de HABG.
- Con una pipeta de diámetro estrecho, triture 10x durante 45 s.
nota: Este es probablemente el paso más crucial y puede disminuir significativamente el rendimiento si no se hace correctamente.
- Aspire el tejido en la pipeta y vacíe inmediatamente el contenido.
- Evite introducir aire, ya que disminuirá significativamente el rendimiento viable.
nota: La pipeta ideal es una pipeta de vidrio de 9". La punta de la pipeta debe pulirse al fuego para suavizar las superficies rugosas. A continuación, se debe siliconar colocándolo en una solución 1:20 de diclorodimetisilano (DMDCS) en cloroformo y O/N izquierdo. A continuación, se debe retirar la pipeta y dejar que se seque al aire. Posteriormente, debe ser esterilizado en autoclave para su esterilización.
cautela: El DMDCS y el cloroformo son altamente inflamables, y la siliconación debe llevarse a cabo en una campana extractora.
- Aspire los 2 mL superiores de sobrenadante y colóquelo en un nuevo tubo de 15 mL etiquetado como "colección".
- Repita los pasos 2.7.3 a 2.7.5 dos veces más (el tubo de recolección de células debe tener 6 ml al final).
- Transfiera lentamente el contenido del tubo de recolección al tubo de gradiente preparado en el paso 2.2, evitando la interrupción del gradiente.
- En este punto, retire el medio neurobasal previamente preparado (Tabla 1) del refrigerador y deje que se caliente en un baño a 37 °C.
- Purifica las neuronas.
- Centrifugar el tubo de gradiente durante 15 min a 800 x g y 22 °C.
- Recoja la(s) capa(s) deseada(s) con una pipeta (Figura 2) y colóquela en un nuevo tubo de 15 mL. Para el aislamiento de neuronas de mayor pureza (es decir, >90%), recoja la capa 3. Para obtener más rendimiento con menos pureza (es decir, >70-80%), recoja las capas 2 y 3.
- Diluya el gradiente de densidad agregando 5 mL de HABG a las capas recién recolectadas.
- Centrifugar a 200 x g durante 2 min a 22 °C.
- Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender en 5 mL de HABG y agite el pellet para suspender las células.
- Centrifugar a 200 x g durante 2 min a 22 °C.
- Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender en 3 mL de medio neurobasal y agite el pellet para resuspender las células.
| Medio | almacenamiento | Ingredientes | preparación |
| HABG | 4 °C/24h | | 100 mL | - Descongelar B27 en nevera a 4 °C O/N
- Filtro esterilizador (0,22 μm) |
| Hibernar A | 97.8 mL |
| B27 [2%] | 2 mL |
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25 mL |
| Medios Neurobasales | 4 °C/1 semana | | 100 mL | - Descongelar B27 en nevera a 4 °C O/N
- Filtro esterilizador (0,22 μm)
- Porciones alícuotas de 50 ml en tubos de 50 ml (almacenar a 4 °C) |
| Neurobasal A | 97 mL |
| B27 [2%] | 2 mL |
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.25 mL |
| Pluma/estreptococos [1%] | 1 mL |
| Medios de digestión | días de aislamiento | | 10 mL | - Agitar vigorosamente
- Déjelo reposar en un baño a 37 °C durante 30 minutos (idealmente preparado 30 minutos antes de usar)
- Filtro esterilizador (0,22 μm) |
| HA-Ca | 10 mL |
| papaína | 25 mg |
| GlutaMAX [0.5 mM] | 0.025 mL |
| Gradiente de densidad | días de aislamiento | | 1 Gradiente | |
| Capa | OptiPrep | HABG |
| (0,13 ml) | (5,29 ml) |
| 1 Parte inferior | 0,26 ml | 1.24 mL |
| número arábigo | 0,19 ml | 1.31 mL |
| 3 | 0,15 ml | 1.35 mL |
| 4 Arriba | 0,11 ml | 1.39 mL |
Tabla 1: Preparación de los medios y soluciones utilizados en este protocolo.
