Knockdown de genes mediados por ARN de horquilla corta en iHSPCs in vitro: un sistema de expresión de shRNA basado en lentivirus que se entrega en iHSPCs para la eliminación de la expresión de genes específicos

Resumen

Fuente: Hsiao, Y. L., et al. Estudio del desarrollo de células dendríticas mediante la eliminación de genes mediada por ARN de horquilla corta en una línea celular madre y progenitora hematopoyética in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

En este video, demostramos un método para realizar la transducción de vectores lentivirales de shRNA para obtener líneas celulares knockdown estables en células madre y progenitoras hematopoyéticas inmortalizadas (iHSPCs).

Protocolo

1. Preparación de líneas celulares hematopoyéticas y progenitoras inmortalizadas (iHSPCs)

1. Mantenga la línea celular iHSPC en un medio RPMI 1640 completo que contenga 100 ng/mL de FL y 1 μM de β-estradiol.
2. Pase las células en una proporción de 1:10 cada 3 días.
   nota: Complete el medio RPMI 1640 suplementándolo con un 10% de suero fetal bovino (FBS), 5 ^x10-5 M β-mercaptoetanol y 10 μg/mL de gentamicina. El FL murino recombinante también está disponible comercialmente.

>2. Transducción lentiviral

1. Placas de iHSPC a una densidad de 1 x 10⁵ células/pocillo en placas de 12 pocillos en 1 mL de medio completo que contiene 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol y 8 μg/mL de polibreno.
   nota: La concentración de polibreno depende de los tipos de células y suele estar en el rango de 4-8 μg/mL.
2. Agregue lentivirus portador de shRNA en cada pocillo a una multiplicidad de infección (MOI) de 100.
   nota: El vector lentiviral es pLKO.1-Puro con un marcador de selección de puromicina (Figura 1). Las secuencias diana de shRNAs frente a LacZ, Tcf4 e Id2, respectivamente, se enumeran en la Tabla de Materiales. El MOI se define por el número de viriones que se añaden por célula durante la infección.
   
3. Girar las placas a 1.100 x g durante 90 min a 37 °C.
4. Incubar la placa que contiene las células infectadas durante toda la noche a 37 °C en una incubadora.
   nota: Si las células son sensibles al polibreno, refresque las células con el medio completo sin polibreno después de la infección por espín.
5. Refresque las células con un medio completo que contenga 100 ng/mL de FL y 1 μM de β-estradiol 24 h después de la infección.
6. Agregue 6 μg/mL de puromicina al medio para seleccionar las células infectadas después de 24 h.
   adicionales nota: El vector lentiviral transducido suele tardar 48 horas en expresar los genes, incluido el gen resistente a la puromicina. Asegúrese de que la concentración de puromicina esté optimizada para cada línea celular.
7. Refresque el medio de selección que contiene 100 ng/mL de FL, 1 μM de β-estradiol y 6 μg/mL de puromicina cada 3 días y mantenga las células durante al menos una semana para expandir las células iHSPC transducidas de manera estable
   nota: La selección de puromicina suele surtir efecto 48 horas después, y el período de selección depende de los tipos de células.

Resultados

Figura 1: Construcción del vector lentiviral pLKO.1-Puro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microtubo de 1,5 mL	ExtraGen	TUBO-170-C
placa tratada con cultivo de tejidos de 12 pocillos	halcón	353043
Suero fetal bovino (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 medio	Gibco	11875-085
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-mercaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250
Ligando Flt3 (FL)	casero
Polibreno	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromicina	Invivogen	ant-pr-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	El Consorcio de ARNi (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	El Consorcio de ARNi (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	El Consorcio de ARNi (TRC)