Edición del genoma CRISPR todo en uno: un método para el knock-in de genes basado en la reparación dirigida por homología en células cultivadas mediante el sistema CRISPR-Cas9

Resumen

Fuente: Zhang, L. et al, Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, demostramos la edición del genoma basada en CRISPR-Cas9 todo en uno en células cultivadas donde Cas9 y sgRNA se proporcionan como una sola construcción de plásmido a las células. El sistema CRISPR-Cas9 y el gen deseado a insertar se introdujo en las células mediante la técnica de electroporación para facilitar el éxito de la edición de genes.

Protocolo

1. Electroporación de macrófagos y líneas de células T

1. Preparación de cultivos celulares para la electroporación
   1. Prepare Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) como medio de crecimiento completo para las células T Jurkat. Prepare el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con 10% de FBS para el cultivo de macrófagos RAW264.7. Complemente todos los medios de crecimiento completos con 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (Pen/Strep), excepto los medios utilizados para la incubación posterior a la transfección antes de la clasificación de l....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ampicilina, sal sódica	MP Biomedicals	194526
Celómetro Mini Contador de Células Automatizado	Nexcelom Biociencia
DPBS (10X), sin calcio, sin magnesio	ThermoFisher Scientific	14200075
Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa	HyClone	SH30022.01
Tubo de ensayo de fondo redondo de poliestireno Falcon 5 ml	BD Biociencias	352003
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	10099141
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
Sulfato de kanamicina	MP Biomedicals	194531
Pipeta multicanal (30-300 μL)	Eppendorf o similar
Sistema de transfección de neón	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Sistema de transfección de neón, kit de 10 μL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Tubos centrífugos estériles cónicos Nunc de 15 mL	ThermoFisher Scientific	339651
Punta de pipeta 0,1-20μl	Eppendorf o similar	0030 075.005
Punta de pipeta 2-200μl	Eppendorf o similar	0030 075.021
Punta de pipeta 50-1000μl	Eppendorf o similar	0030 075.064
pX458-DSRED2	Addgene	112219
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 Medio	HyClone	SH30027.01
Penicilina-Estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Solución de azul de tripano, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
Microtubos de 1,5 mL, PCR-clean	Eppendorf o similar	0030 125.215
Placas de pocillos múltiples transparentes de 24 pocillos tratados con TC	Corning	3524