Edición del genoma CRISPR todo en uno: un método para el knock-in de genes basado en la reparación dirigida por homología en células cultivadas mediante el sistema CRISPR-Cas9

Resumen

Fuente: Zhang, L. et al, Gene Knock-in por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, demostramos la edición del genoma basada en CRISPR-Cas9 todo en uno en células cultivadas donde Cas9 y sgRNA se proporcionan como una sola construcción de plásmido a las células. El sistema CRISPR-Cas9 y el gen deseado a insertar se introdujo en las células mediante la técnica de electroporación para facilitar el éxito de la edición de genes.

Protocolo

1. Electroporación de macrófagos y líneas de células T

1. Preparación de cultivos celulares para la electroporación
   1. Prepare Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) como medio de crecimiento completo para las células T Jurkat. Prepare el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con 10% de FBS para el cultivo de macrófagos RAW264.7. Complemente todos los medios de crecimiento completos con 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina (Pen/Strep), excepto los medios utilizados para la incubación posterior a la transfección antes de la clasificación de las células.
   2. Realice el subcultivo de las células T RAW264.7 y Jurkat de acuerdo con las instrucciones del proveedor (consulte la tabla de materiales). Al subcultivar células RAW264.7, utilice una solución de tripsina-EDTA (0,25%) para separar las células. Utilice FBS suplementado con DMSO al 10% (v/v) como medio de criopreservación para las células RAW264.7 y Jurkat.
   3. Recoja células a 250 × g durante 5 minutos para los macrófagos RAW264.7 y a 90 × g durante 8 minutos para las células T Jurkat. A continuación, lavar con 5-10 mL de 1× DPBS (sin iones Ca²⁺ o Mg²⁺). Retire el DPBS.
   4. Vuelva a suspender el pellet celular con 2 mL de 1× DPBS. Utilice 10 μL de células y mezcle con un volumen igual de 0,2% de azul de tripano para estimar el recuento de células y la viabilidad.
      nota: Asegúrese de que el cultivo celular tenga una viabilidad del >90% el día de la transfección.
   5. Para un solo experimento de knock-in, realice la electroporación con puntas de nucleofección de 10 μL con cinco repeticiones. Calcule el volumen necesario para 2.0 × 106 celdas y granule las celdas por centrifugación. Lave el pellet de celda nuevamente con 1× DPBS como se describe en el paso 1.1.2.
      nota: Cuando se utilizan puntas de nucleofección de 10 μL, se necesitan 4,0 × 10⁵ celdas por electroporación. En consecuencia, prepare al menos 2.0 × 10⁶ celdas para un experimento de knock-in.
   6. Prepare una placa de 24 pocillos con 0,5 mL de medio de crecimiento completo (preparado en el paso 1.1.1) por pocillo sin pluma/estreptococo y precaliente en una incubadora a 37 °C.

>2. Electroporación de los componentes de CRISPR/Cas9 y el vector de focalización

1. Encienda el sistema de electroporación. Utilice parámetros de electroporación optimizados de la siguiente manera: pulsos de 1.400 V/20 ms/2 para macrófagos RAW264.7 y pulsos de 1350 V/20 ms/2 para células T Jurkat.
2. Para tener en cuenta la pérdida de muestras debida al pipeteo, prepare una mezcla de electroporación de 55 μL en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL que contenga 2,5 μg de cada vector CRISPR/Cas9 (pDsR-mR26-sg1 y pDsR-mR26-sg2 para el locus knock-in de mRosa26, y pDsR-hR26-sg1 y pDsR-hR26-sg2 para el locus hROSA26), 2,4 μg del vector de focalización linealizado (pKR26-POI-iBFP o pKhR26-POI-iBFP para mRosa26 y hROSA26knock-in, linealizado por EcoRI o BamHI), y el tampón de resuspensión R.
   nota: Para ahorrar tiempo, la mezcla de electroporación se puede preparar durante la centrifugación (paso 1.1.5).
3. Vuelva a suspender 2.0 × 10⁶ celdas (preparadas en el paso 1.1.5) en la mezcla de electroporación de 55 μL del paso 1.2.2.
4. Aspirar la mezcla de célula/electroporación del paso 1.2.3 utilizando una punta de nucleofección de 10 μL con una pipeta.
   nota: Durante el pipeteo, evite introducir burbujas de aire, ya que pueden provocar fallos en la electroporación.
5. Agregue la muestra a un tubo lleno de 3 mL de tampón E del kit de electroporación.
6. Aplique los parámetros de electroporación para los dos tipos de celdas como se describe en el paso 1.2.1.
7. Transfiera la muestra a un pocillo de la placa de 24 pocillos con medio precalentado del paso 1.1.6.
8. Repita los pasos 1.2.4-1.2.7 para las otras cuatro repeticiones, así como para los controles solo del vector de orientación y solo del vector de expresión CRISPR.
   nota: Cambie la punta y el tubo de nucleofección cuando cambie a un tipo de célula/ADN plasmídico diferente.
9. Cultive las células transfectadas durante 48-72 h para permitir la recuperación después de la electroporación y la expresión de los componentes CRISPR/Cas9 antes del análisis de citometría de flujo o la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ampicilina, sal sódica	MP Biomedicals	194526
Celómetro Mini Contador de Células Automatizado	Nexcelom Biociencia
DPBS (10X), sin calcio, sin magnesio	ThermoFisher Scientific	14200075
Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa	HyClone	SH30022.01
Tubo de ensayo de fondo redondo de poliestireno Falcon 5 ml	BD Biociencias	352003
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher Scientific	10099141
Jurkat	ATCC	TIB-152	https://www.atcc.org/
Sulfato de kanamicina	MP Biomedicals	194531
Pipeta multicanal (30-300 μL)	Eppendorf o similar
Sistema de transfección de neón	ThermoFisher Scientific	MPK5000
Sistema de transfección de neón, kit de 10 μL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Tubos centrífugos estériles cónicos Nunc de 15 mL	ThermoFisher Scientific	339651
Punta de pipeta 0,1-20μl	Eppendorf o similar	0030 075.005
Punta de pipeta 2-200μl	Eppendorf o similar	0030 075.021
Punta de pipeta 50-1000μl	Eppendorf o similar	0030 075.064
pX458-DSRED2	Addgene	112219
RAW264.7	ATCC	TIB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 Medio	HyClone	SH30027.01
Penicilina-Estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Solución de azul de tripano, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
Microtubos de 1,5 mL, PCR-clean	Eppendorf o similar	0030 125.215
Placas de pocillos múltiples transparentes de 24 pocillos tratados con TC	Corning	3524